Differential Scanning Fluorescence를 통한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출

요약

이 프로토콜은 화합물과 단백질 분자 간의 결합을 검출하는 고유한 방법을 설명하며, 단백질 샘플 손실을 최소화하고 데이터 정확도가 높다는 이점을 제공합니다.

초록

서로 다른 분자 간의 상호 작용에 대한 조사는 질병 발병 기전을 이해하고 약물 표적을 스크리닝하는 데 중요한 측면입니다. 티베트 의학 Vicatia thibetica의 활성 성분인 Umbelliferone은 메커니즘을 알 수 없는 면역 조절 효과를 나타냅니다. CD40 단백질은 면역 반응의 핵심 표적입니다. 따라서 본 연구는 시차주사형광기술의 원리를 이용하여 형광효소마커를 이용하여 CD40 단백질과 움벨리페론의 상호작용을 분석한다. 초기에 단백질 형광 오렌지 염료의 안정성을 실험적으로 검증하고 1:500의 최적 희석 비율을 결정했습니다. 그 결과, CD40 단백질의 온도 용융(Tm) 값이 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있음을 관찰했습니다. 흥미롭게도, CD40 단백질과 umbelliferone 사이의 상호 작용은 CD40 단백질의 열 안정성을 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이 연구는 형광 마이크로플레이트와 형광 염료를 사용하여 저분자 화합물 및 단백질의 결합 잠재력을 감지하려는 최초의 시도입니다. 이 기술은 높은 감도와 정확성이 특징이며 단백질 안정성, 단백질 구조 및 단백질-리간드 상호 작용 분야에서 유망한 발전을 약속하여 추가 연구 및 탐색을 용이하게 합니다.

서문

비카티아 티베티카(Vicatia thibetica ) H. Boissieu는 티베트 의학에서 일반적으로 사용되며, 5가지 기본 성분(Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. 및 Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) ¹. 주로 윈난성 북서부, 쓰촨성 서부, 티베트 및 기타 지역과 같은 중국 남서부에 분포하며 말린 뿌리는 Angelica¹의 현지 대체품 역할을합니다. 향기로 유명한 뿌리는 종종 스튜 조미료로 사용되며, 티베트 셀러리라고 불리는 잎은 맛있는 요리에 기여합니다. 따라서 Vicatia thibetica 는 독특한 약용 식물뿐만 아니라 티베트의 식품 공급원으로도 중요합니다.

국내외 연구에 따르면 Vicatia thibetica는 혈액 보충 및 기(힘 또는 에너지) 활력을 주는 특성을 가지고 있어 월경 조절에 도움이 됩니다. 두근거림항진과 혈액 결핍으로 인한 불규칙한 월경통의 증상을 해결하기 위해 사용되며, 신체 면역의 항산화 조절과 같은 약리학적 효과를 나타낸다². 비카티아 티베티카(Vicatia thibetica)의 알코올 추출물은 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)에 의해 유발된 면역력이 저하된 쥐의 체질량과 장기 지수를 회복하는 능력을 입증했습니다. 또한 혈청 내 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성을 증가시키고 말론디알데히드의 함량을 감소시켜 항산화 능력의 향상과 지질 과산화 ^2,3에 대한 균형 효과를 시사합니다. 동시에 혈액 세포와 헤모글로빈의 수를 증가시켜 신체의 조혈 기능을 객관적으로 반영할 뿐만 아니라 면역 체계에 중요한 역할을 합니다 ^2,3.

침상 결정과 쓴 맛이 특징인 Umbelliferone은 분자량이 작고 휘발성이며 증기로 증류할 수 있습니다. 그것은 쉽게 승화하고 물에 대한 용해도가 낮고 유기물에 대한 용해도가 높습니다. Vicatia thibetica의 주요 화학 성분 중 하나인 umbelliferone은 하이드로코르티손 유도 면역억제 마우스 모델 ^4,5에서 세포 면역, 체액성 면역 및 비특이적 면역에 대한 면역조절 효과를 나타냅니다.

종양괴사인자 수용체 슈퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily)의 구성원인 세포 표면 분자 CD40은 면역 세포에서 널리 발현됩니다⁶. CD40L이라고도 하는 상동 리간드인 CD154는 활성화된 T 림프구에 의해 발현되는 II형 막관통 단백질입니다. CD40 활성화는 수지상세포(DC)와 단핵구의 표면에서 공동 자극 분자의 발현을 상향 조절할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이 과정은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 항원 제시 기능을 촉진하고 CD8+ T 세포를 더욱 활성화시킨다⁷.

대식세포는 종양 미세환경의 형성과 조절에 중요한 역할을 하며, CD40 활성화는 대식세포에 의한 종양 미세환경의 리모델링을 향상시킬 수 있다⁸. CD40 신호 활성화는 B 세포의 증식과 활성화에 큰 영향을 미칩니다. B 세포는 CD40에 의해 활성화될 때 효과적인 항원 제시 세포로 기능할 수 있습니다. 이들은 항원을 제시하고, effector T cell 활성을 생성하며, 이에 따라 항종양 효과에 기여한다⁹. 또한, 종양 세포에서 CD40 활성화는 세포사멸을 유도하고 종양 성장을 억제할 수 있다¹⁰. CD40은 주로 Lyn, Fyn, Syk 등을 포함한 비수용체 티로신 단백질 키나아제의 활성을 조절하여 신호를 전달합니다. 또한 Bcl-xL, Cdk4 및 Cdk6 단백질을 자극하고, Rel/NF-kB 전사 인자를 활성화하고, CG-2 및 PI3K¹⁰을 인산화하는 능력이 있습니다.

DSF(Differential Scanning Fluorescence) 방법은 완충액 조성, 온도 및 저분자 리간드와 같은 다양한 환경 조건이 단백질 구조의 열적 안정성에 미치는 영향을 평가하는 데 널리 사용됩니다. DSF에 일반적으로 사용되는 염료는 주황색, 환경에 민감한 소수성 염료입니다. 정상적인 조건에서는 단백질 구조가 접혀 내부적으로 소수성 세그먼트가 숨겨집니다. 온도가 상승함에 따라 단백질의 소수성 영역이 더 많이 노출되어 자연 단백질 구조가 점진적으로 파괴됩니다. 염료는 이 노출된 단백질 부분에 선택적으로 결합하여 형광을 증폭합니다. 그런 다음 형광 신호 검출(¹¹)의 변화를 모니터링하여 Tm 값을 계산합니다. 어느 정도까지, Tm 값의 변화는 돌연변이, 완충액의 변화 또는 리간드 결합으로 인한 단백질 안정성의 변화를 측정할 수 있습니다. 또한, 단백질 접힘 과정(protein folding process) 동안의 구조적 변화를 나타낼 수 있다¹². 이 접근법은 정확한 데이터, 넓은 온도 범위, 높은 감도 및 최소한의 단백질 샘플 손실을 제공합니다¹³.

이 연구에서는 형광 정량 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치 대신 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 측정을 수행했습니다. 이러한 수정을 통해 형광 정량 PCR 기기가 없는 실험실에서 DSF를 검출할 수 있으므로 분석법이 덜 복잡해지고 기기 설정에 필요한 단계가 줄어들어 실험 프로세스가 간소화됩니다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 복잡성은 줄어들지만 절차는 더 번거로워집니다. 다양한 온도에서 수동 형광 검출이 필요하며, 시스템에서 형광을 자동적이고 지속적으로 수집할 수 없습니다. 따라서 이 연구는 DSF 기술을 활용하여 CD40 단백질과 움벨리페론 사이의 상호 작용을 탐구하여 티베트 의학의 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

프로토콜

화합물 용액, 단백질 용액 및 염료를 PBS 용액에 도입했습니다. 그 후, 샘플은 디지털 가열 진탕 건식 수조를 사용하여 점진적으로 가열하고, 복잡한 시스템 내에서 형광 강도의 변화를 측정하여 단백질의 열적 안정성을 평가했습니다. 자세한 단계는 아래에 설명되어 있으며 그림 1 은 프로토콜의 개요를 보여줍니다.

1. 솔루션 준비

1. 0.1mg의 umbelliferone을 616.75μL의 DMSO 용액에 첨가하여 1mM umbelliferone 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 0.1mg의 CD40 내지 500 μL의_ddH2O용액을 첨가하여 200 μg/mL CD40 단백질 용액을 준비한다( 재료 표 참조).
3. 1μL의 5000x 주황색 염료를 9μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 첨가하여 500x 주황색 염료 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
   참고: 얼음에 대해 위의 작업을 수행하고 피펫의 최소 범위는 0.1μL이므로 처음에 주황색 단백질 염료를 10배로 희석하여 후속 사용을 용이하게 합니다.

2. 염료 성능 테스트

1. 500x 주황색 염료를 PBS 용액에 넣고 희석하여 염료(PBS 비율이 1:500, 1:1000, 1:2000 및 1:4000)가 되도록 합니다.
   알림: DMSO의 최종 농도가 2%(v/v)를 초과하지 않는지 확인하십시오.
2. 형광 마이크로플레이트 리더를 켜고 10분 동안 예열합니다.
3. 컴퓨터와 데이터 수집 소프트웨어를 순서대로 엽니다( 재료 표 참조).
4. Instrument를 클릭하고 해당 형광 마이크로플레이트 모델을 선택한 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 OK를 선택합니다.
   참고: 형광 마이크로플레이트가 예열을 완료하고 패널에 온도를 표시할 때까지 기다렸다가 데이터 수집 소프트웨어를 열어 기기와 소프트웨어 간의 성공적인 연결을 확인하십시오.
5. Acquisition Settings(획득 설정)를 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 Fluorescence(형광)를 선택합니다.
6. 파장 인터페이스에서 프로그램을 편집합니다: Lm1 = 470 nm, 570 nm를 선택한 다음 확인을 선택합니다.
   참고: 주황색 염료는 300nm의 UV 광 또는 470nm의 가시광선으로 여기될 수 있으며 방출은 570nm에서 측정할 수 있습니다.
7. 다양한 농도의 주황색 염료(1:500, 1:1000, 1:2000 및 1:4000)와 PBS를 100μL/웰의 96웰 플레이트에 추가합니다.
   참고: PBS에 첨가하기 전에 DMSO에 용액을 용해시키고 염료의 침전 경향으로 인해 완전히 용해되도록 준비 과정에서 2000 x g 에서 완전히 소용돌이치십시오.
8. 96웰 플레이트를 기기의 검출 단계에 놓고, 데이터 수집 소프트웨어에서 읽기 버튼을 클릭하고, 각 염료 농도의 형광을 실온에서 매번 2분 간격으로 13회 측정합니다.
9. 각 결정 후 내보내기 버튼을 클릭하고, XML XLS TXT로 내보내기를 선택하고, 모든 플레이트를 선택한 다음, 출력 형식의 플레이트를 선택하고, 마지막으로 확인을 클릭하여 추가 분석을 위해 "XLS" 형식의 폴더에 데이터를 저장합니다.
   참고: 이 단계는 실온에서 오렌지 염료의 자가형광에 대한 연속 측정의 영향을 결정하고 최적의 염색 농도를 식별하는 데 도움이 됩니다.
10. 디지털 가열 진탕 건욕을 켜고 가열 온도를 35°C, 가열 시간을 2분으로 설정합니다.
11. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 염료의 최적 희석 비율을 준비하고 디지털 가열 진탕 건욕에 2분 동안 넣습니다.
12. PBS 용액과 35°C에서 가열된 염색 용액을 웰당 100μL의 부피로 96웰 플레이트에 추가합니다.
13. 96웰 플레이트를 기기의 검출 단계에 놓고 데이터 수집 소프트웨어에서 Read 버튼을 클릭합니다.
14. 가열 온도를 40°C로, 가열 시간을 2분으로 설정합니다.
15. 96웰 플레이트의 염료 용액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 다시 피펫팅하고 기기에서 2분 동안 가열합니다.
16. 2.12-2.15 단계 및 2.9 단계의 작업을 반복하여 각각 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C 및 95 °C에서 염료 용액의 흡광도를 테스트합니다.
    참고: 이 단계는 35 °C에서 95 °C까지의 구배에서 연속 가열 하에서 주황색 염료의 자가형광 안정성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 급격한 온도 강하나 실험 오류로 이어질 수 있는 잘못된 액체를 추가하지 않도록 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.

3. 단백질의 온도 용융(Tm) 감지

1. CD40 단백질과 오렌지 염료를 PBS 용액과 결합하여 각각 5μg/mL, 10μg/mL, 15μg/mL, 20μg/mL 및 1:500의 최종 농도를 달성합니다.
2. 2.2-2.6단계 및 2.10-2.16단계에 설명된 작업을 반복하여 각각 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C 및 95°C의 온도에서 CD40 단백질 용액의 흡광도를 평가합니다.
3. 2.9단계를 반복하여 데이터를 저장 및 분석한 다음 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Tm 값을 계산합니다( 재료 표 참조).
4. CD40 단백질, 움벨리페론 및 오렌지 염료를 PBS 용액에 첨가하여 각각 5μg/mL, 10μg/mL, 15μg/mL, 20μg/mL, 10μM 및 1:500의 최종 농도를 얻습니다.
   참고: 용액 준비 중 격렬한 와류는 PBS에서 염료, CD40 단백질 및 umbelliferone의 균일한 분포를 보장하는 데 필수적입니다.
5. 3.2-3.3 단계의 작업을 반복하여 각각 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C 및 95 °C의 온도에서 CD40-umbelliferone 복합체 용액의 흡광도를 측정합니다.
   참고: 이 단계는 CD40 단백질 및 CD40-umbelliferone 복합체의 Tm 값을 결정하기 위해 수행되었으며, umbelliferone에 대한 최적의 CD40 단백질 결합 농도를 식별하는 것을 목표로 합니다.

결과

주황색 염료는 실온 및 고온 모두에서 E_x = 470 nm 및 E_m = 570 nm에서 안정적인 형광 여기를 일관되게 나타냈습니다. 1:500의 최적 희석 비율이 결정되었습니다(그림 2A,B). CD40 단백질의 농도가 15μg/mL 미만일 때는 Tm 값을 검출하기가 어려웠습니다(그림 3A,B). 그러나 15μg/mL의 농도에서는 51.82°C의 안정적인 Tm 값이 검출되었으며, CD40 단...

토론

열 이동 분석 또는 열 형광 분석으로도 알려진 DSF는 느리고 프로그래밍된 온도 상승 동안 테스트 샘플 또는 염료의 형광 신호 변화를 모니터링하여 샘플에서 단백질의 열 변성 과정을 감지하는 데 사용되는 기술입니다. Pantoliano¹⁴에 의해 처음 확립된 DSF는 고처리량 방법 역할을 합니다. 주요 절차에는 컴퓨터로 제어되는 가열판의 온도를 높이고, 장파장 자외선 램프를 사용하여 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD40 protein	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 multifunctional microplate reader	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO orange dye	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854