Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Resumen

Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Resumen

La reparación del cartílago en las enfermedades articulares crónicas exige terapias avanzadas basadas en células para regenerar los tejidos dañados de manera efectiva. Este protocolo proporciona un método paso a paso para diferenciar células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en esferoides basados en condrocitos, lo que respalda las aplicaciones de ingeniería de tejidos y terapia celular. El proceso de diferenciación está cuidadosamente estructurado para promover el compromiso del linaje condrogénico, comenzando con iPSCs cultivadas en medios específicos que guían secuencialmente a las células a través de etapas críticas de diferenciación. Inicialmente, las iPSCs se expanden para alcanzar una confluencia óptima antes de la inducción hacia el linaje condrogénico utilizando una serie de cambios de medio definidos. Para el día 10, las células se transforman en un medio promotor de la condrogénesis que mejora la formación de células similares a los condrocitos que expresan marcadores clave de condrocitos maduros. Una mayor agregación en placas recubiertas de agarosa de 96 pocillos conduce a la formación de esferoides tridimensionales, que luego se cultivan en mini-biorreactores personalizados diseñados para simular un microambiente que fomenta la deposición de la matriz extracelular (ECM). Al permitir la producción escalable de esferoides de condrocitos que imitan las características del cartílago nativo, este enfoque ofrece una solución prometedora y reproducible para el desarrollo de tratamientos basados en células para los defectos del cartílago, proporcionando una amplia utilidad para aplicaciones clínicas y de investigación en medicina regenerativa musculoesquelética.

Introducción

La prevalencia de la enfermedad articular conlleva importantes cargas económicas debido al creciente número de pacientes discapacitados y a los costes asociados a su atención. El cartílago hialino es un tejido conectivo avascular con un potencial regenerativo limitado¹. El uso prolongado de ciertos medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), glucocorticoides y quimioterapia o radioterapia puede disminuir aún más la capacidad regenerativa del cartílago, eliminando casi por completo su capacidad de^curación. Esto dificulta la obtención de células autólogas de cartílago para la ter....

Protocolo

El estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la LOPUKHIN FRCC PCM (protocolo n.º 2019/02 del 9 de abril de 2019). Todas las muestras de los donantes se obtuvieron de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes y/o de sus tutores legales.

NOTA: Mantener la técnica estéril durante todo el protocolo. Calentar todos los medios y soluciones de cultivo a 37 °C antes de aplicarlos a células o esferoides. Cultive las células en una incubadora de CO₂ a 37 °C, con 5% de CO₂ sobre 80% de humedad. El esq....

Resultados

El protocolo descrito se ilustra en la Figura 1. Esta metodología emplea dos medios de cultivo distintos para impulsar la diferenciación de las iPSC en esferoides condrocitos durante una duración mínima de 1 mes (Figura 2). El proceso de diferenciación se inicia cuando las iPSC alcanzan una confluencia del 75%-90% (Figura 1B). Los primeros indicadores de diferen.......

Discusión

Las iPSC representan una herramienta transformadora en la medicina regenerativa, ya que ofrecen el potencial de generar condrocitos específicos del paciente para la reparación del cartílago. Los protocolos actuales aprovechan la diferenciación dirigida a través de las vías mesodérmicas, con moléculas de señalización clave como TGF-β y BMP-2 que promueven el compromiso del linaje condrocítico. Estos métodos tienen como objetivo replicar el desarrollo del cartílago embrionari.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin solution	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0.25% Trypsin solution	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle's medium	Thermo Fisher Scientific	12634028
Aggrecan Monoclonal Antibody	Invitrogen	AHP0022	Host: Mouse; Dilution: 1/500
Ascorbic acid	Sigma	A4544	50 μg/mL
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x or 2%
Beta-mercaptoethanol	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μM
COL1A1 (E6A8E) Monoclonal antibody	CellSignalling	39952	Host: Rabbit; Dilution: 1/800
COL2A1 (M2139) Monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-52658	Host: Mouse; Dilution: 1/50
Collagenase type II solution	PanEco	P011-2	0.01%
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μg/mL
DMEM medium w/o glutamine	PanEco	С420п
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
Hanks' solution	PanEco	Р020п
Hybris 8 medium	PanEco	С780Е/Ф780
Insulin-Transferrin-Selenium solution	PanEco	Ф065	1x solution has the following concentrations: Insulin: 10 µg/mL; Transferrin: 5.5 µg/mL; Selenium 5 ng/mL
L-alanyl-L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μg/mL
Penicillin-Streptomycin solution	PanEco	А063п	100 U/mL
Retinoic acid	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Rho kinase inhibitor Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Secondary Antibody Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Host: Goat; Dilution: 1/500
Secondary Antibody Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	А32732	Host: Goat; Dilution: 1/500
Sox9 (D8G8H) Monoclonal antibody	CellSignalling	82630	Host: Rb; Dilution: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/mL