Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8

Resumen

El aislamiento de^las MSCs^{BAMBI altas}en MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs.

Resumen

Las células madre estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical (UC-MSC) presentan una baja inmunogenicidad y potentes efectos inmunomoduladores para el tratamiento de diversas enfermedades. Las UC-MSC humanas son una población heterogénea que consta de tres subpoblaciones principales con diferentes formas celulares, tasas de proliferación, capacidades de diferenciación y funciones inmunorreguladoras. Anteriormente, se descubrió que las BAMBI^altasMFGE8 UC-MSCs, el primer subgrupo aislado con éxito de las UC-MSC, no lograron aliviar la nefritis lúpica. Por lo tanto, la función y el mecanismo subyacente de este subgrupo en la terapia de MSC para enfermedades sigue siendo desconocida. Es necesario aislar e investigar más a fondo las BAMBI^altasMFGE8^UC-MSC en términos de su fenotipo, metabolismo y función para comprender completamente la naturaleza de este subgrupo de MSC. En este protocolo, describimos un método detallado para aislar^{la subpoblación} BAMBI^altaMFGE8 de las UC-MSC humanas. La subpoblación de UC-MSCs se marca con dos marcadores de superficie, BAMBI y MFGE8, mediante clasificación por citometría de flujo. Las células aisladas se cultivan y verifican mediante análisis de citometría de flujo. Los genes específicos expresados en las BAMBI^altasMFGE8 y UC-MSC^se identifican mediante RT-qPCR. Este protocolo da como resultado una clasificación celular pura y altamente eficiente y describe los perfiles de marcadores de las BAMBI^altas, MFGE8 y UC-MSC^altas.

Introducción

Las células madre o estromales mesenquimales humanas (MSC) son progenitores somáticos capaces de diferenciarse en osteocitos, adipocitos, condrocitos y otros tipos de células¹. Las MSC se aislaron por primera vez de la médula ósea y se derivan ampliamente del cordón umbilical, el tejido adiposo y otros tejidos². Debido a que las UC-MSC se obtienen fácilmente y exhiben baja inmunogenicidad y efectos inmunosupresores, se aplican ampliamente en ensayos clínicos para tratar diversas enfermedades ^3,4,5. Aunque la terapia con MSC muestra un potencial prometedor para el tratamiento de enfermedades, los efectos terapéuticos son inconsistentes entre individuos⁶. Sin embargo, la razón de la inestabilidad de la terapia MSC aún no está clara.

Las fluctuaciones moleculares, la morfología, la capacidad de diferenciación y la función terapéutica comprenden la heterogeneidad de las MSC. Algunos estudios también han postulado que las MSCs constituyen subpoblaciones con diferentes funciones ^7,8 y han explorado la heterogeneidad de las MSC a través de la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq)^9,10. Los resultados revelaron que las UC-MSC humanas tienen distintas subpoblaciones con características transcriptómicas específicas, mientras que pocos estudios han aislado con éxito las llamadas subpoblaciones de MSC. Previamente diseccionamos las UC-MSC humanas en tres subgrupos según sus firmas a través de scRNA-seq y análisis bioinformático, en los que la subpoblación BAMBI^altaMFGE8^alta UC-MSC se purificó aún más y se probó funcionalmente¹¹. Sin embargo, este subgrupo no logró aliviar la nefritis lúpica. Por lo tanto, es necesario probar los efectos terapéuticos de BAMBI^altoMFGE8^alto MSC en otros trastornos para comprender sus funciones auténticas.

Este protocolo describe los métodos para aislar^{el subgrupo} BAMBI^altoMFGE8 alto de UC-MSC humanas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) mediante citometría de flujo y las características del subgrupo BAMBI^altoMFGE8^alto.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki de 1989 y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado Drum Tower de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing (número de aprobación: 202019701). Los cordones umbilicales humanos se obtuvieron de madres sanas en el Hospital Afiliado Drum Tower de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing después del parto natural, quienes dieron su consentimiento informado para su uso en este trabajo. Las UC-MSCs primarias se aislaron de cordones umbilicales humanos, como se informó previamente¹¹.

1. Cultivo e identificación de UC-MSC antes del aislamiento

1. Una vez que las MSC alcancen el 70-80% de confluencia (P0), lavar las células una vez con PBS y añadir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% durante 2 min a 37 °C. Luego, agregue 9 mL de medio completo para neutralizar la tripsina, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugue a 300 × g durante 5 min para recolectar las células. Deseche el sobrenadante y agregue el medio completo adecuado para resuspender las células. Transfiera las células de cada placa a tres matraces T75 (P1) y cultive en una incubadora celular a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Después de pasar las UC-MSCs 2x a través de la tripsinización, en P3, recoja las células siguiendo los mismos pasos descritos en el paso 1.1. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en el tampón de tinción FACS (1x PBS que contenga 2% de FBS) y cuéntelas. Añadir tampón de tinción FACS hasta una concentración final de 5-10 × 10⁶ células/mL y mantener la suspensión celular en hielo.
3. Distribuya 100 μL por tubo de esta suspensión celular en diferentes tubos de 1,5 mL. Añadir controles de isotipo y anticuerpos FACS contra CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 y HLA-DR (todos a 1:200) a las células a 4 °C durante 30 min.
4. Lavar las células 2 veces con el tampón de tinción FACS y centrifugar a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los precipitados en 200 μL de tampón de tinción FACS para el análisis de citometría de flujo para identificar marcadores MSC.

2. Aislamiento de BAMBI^alto MFGE8^alto UC-MSC por citometría de flujo

1. Cultive UC-MSC a una densidad de aproximadamente 5-10 × 10⁶ células al aislar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs. Disociar las células con EDTA 0,5 mM durante 5 min hasta que empiecen a tener una morfología redonda, añadir el medio completo para transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para preparar una suspensión unicelular. Utilice 10 μL de la suspensión celular para contar las células y calcular el número total de células recolectadas. Centrifugar el tubo cónico con la suspensión celular a 300 × g durante 5 min para recoger las células.
2. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio completo hasta una concentración final de 5-10 × 10⁶ células/mL y mantenga la suspensión celular en hielo.
3. Divida las celdas en cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (solo celdas en blanco; Células marcadas con BAMBI; Células marcadas con MFGE8; y células marcadas con BAMBI y MFGE8).
4. Agregue anticuerpos primarios a concentraciones apropiadas (MFGE8 y BAMBI, ambos a 1:100) a los tubos, mezcle e incube las células a temperatura ambiente durante 15 minutos.
5. Lave las celdas marcadas una vez con 1x PBS y centrifugue a 300×g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de medio completo, agregue anticuerpos secundarios fluorescentes conjugados (IgG H&L anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647, todos a 1: 1,000) a las células, mezcle e incube las células a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad.
6. Lave las celdas marcadas una vez con 1x PBS, como se describe en el paso 2.5. Vuelva a suspender las células en 500 μL de medio completo, filtre a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar grumos y residuos, y transfiera el filtrado a un tubo de 15 mL para la clasificación por citometría de flujo.
7. Ejecute el tubo de células en blanco sin agregar un anticuerpo (control negativo) y ajuste la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para controlar la escala de la población negativa con tinción de anticuerpos.
8. Ejecute los tubos de células marcadas con anticuerpos individuales (es decir, MFGE8 + IgG H&L anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488, o BAMBI + IgG DE CABRA ANTI-CONEJO h&L Alexa Fluor 647) como control de compuerta para determinar dónde comienza la positividad en la parcela.
9. Ejecute los tubos de muestra experimentales para clasificar y recolectar la alta población de^{células BAMBI}MFGE8.
10. Coloque las MSC^{BAMBI altas}MFGE8^clasificadas en una placa de 24 pocillos y cultive las células en una incubadora de células a 37 °C y 5% de CO₂.
11. Cuando las MSC clasificadas con^{alto contenido}de MFGE8 con^alto contenido de MFGE8 hayan crecido durante dos pasos para obtener suficientes células, disocie las células y realice un análisis posterior a la clasificación para garantizar la pureza de las poblaciones de células clasificadas mediante citometría de flujo, como se describe en los pasos 2.1-2.9. Alternativamente, examine la pureza de las células clasificadas con inmunofluorescencia convencional frente a la expresión humana de BAMBI y MFGE8 si el número de células recolectadas es demasiado pequeño.

3. Caracterización de^{las MSCs BAMBI de alto} MFGE8

1. Cultive las MSC clasificadas^{BAMBI altas}MFGE8^en una placa de 12 pocillos, examine su morfología celular bajo un microscopio y compárelas con la de las MSC sin clasificar.
   NOTA: En general^{, las} celdas BAMBI^{con alto}contenido de MFGE8 crecen más rápido que las UC-MSC sin clasificar.
2. Cuando las células tengan aproximadamente un 90% de confluentez en la placa de 12 pocillos, aspire el medio de cultivo celular, lave las células una vez con 1x PBS y agregue 500 μL de reactivo de extracción de ARN a las células. Agite el plato lentamente a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
3. Pipetear la mezcla y transferirla a un tubo libre de RNasa y DNasa. Añadir 100 μL de cloroformo, tapar el tubo y agitar la mezcla vigorosamente mediante vórtice durante 15 s. Luego, deje que el tubo permanezca en RT durante 3 minutos.
4. Centrifugar el tubo durante 15 min a 11.000 × g y 4 °C.
5. Transfiera aproximadamente 200 μL de la capa acuosa superior a un tubo nuevo. Agregue el mismo volumen de isopropanol y pipetee bien hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, deje reposar la mezcla a RT durante 10 minutos.
6. Centrifugar durante 15 min a 11.000 × g y 4 °C. Deseche el sobrenadante.
7. Agregue 500 μL de etanol al 75% al pellet en el tubo e invierta el tubo suavemente varias veces.
8. Centrifugar el tubo durante 5 min a 6.000 × g y 4 °C. Deseche el sobrenadante. Repita la centrifugación una vez durante 10 s a 6.000 × g, aspire cuidadosamente el líquido restante con una pipeta y seque el tubo a RT.
9. Agregue 10 μL de agua libre de ARNasa para disolver la pastilla de ARN y mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro.
10. Siga las instrucciones del fabricante para sintetizar ADNc de primera cadena a partir de hasta 1 μg de ARN total.
11. Utilice un kit de qPCR para detectar y cuantificar la expresión génica, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Las secuencias de los cebadores de ADN utilizados se enumeran en la Tabla 1.

Resultados

La Figura 1 muestra los perfiles de expresión de marcadores de superficie celular de UC-MSC humanas. Las MSC cultivadas fueron fuertemente positivas para la expresión de CD44, CD73, CD90 y CD105 y negativas para la expresión de CD14, CD34, CD45, CD79 y HLA-DR. Las^{BAMBI con alto}contenido de MFGE8 se clasificaron a partir de las UC-MSC humanas cultivadas, y su expresión de BAMBI y MFGE8 se volvió a analizar mediante citometría de fl...

Discusión

Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer la subpoblación^{BAMBI alta}MFGE8 alta de UC-MSCs humanas. El método es importante para el estudio posterior de la morfología, el crecimiento y la función de este subgrupo de MSC. Algunos pasos son vitales para el aislamiento exitoso y el alto rendimiento de las celdas BAMBI^{de alto}MFGE8.

En primer lugar, el aspecto técnico más crítico a tener en cuenta es el uso d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111