Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Zusammenfassung

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBI^hochMFGE8^hoch UC-MSCs vor.

Zusammenfassung

Aus der Nabelschnur gewonnene mesenchymale Stroma-/Stammzellen (UC-MSCs) weisen eine geringe Immunogenität und starke immunmodulatorische Wirkungen bei der Behandlung verschiedener Krankheiten auf. Humane UC-MSCs sind eine heterogene Population, die aus drei Hauptsubpopulationen mit unterschiedlichen Zellformen, Proliferationsraten, Differenzierungsfähigkeiten und immunregulatorischen Funktionen besteht. Zuvor wurde festgestellt, dass^BAMBI-hoheMFGE8-hohe UC-MSCs, die erste Untergruppe, die erfolgreich aus UC-MSCs isoliert wurde, die Lupusnephritis nicht lindern konnte. Daher ist die Funktion und der zugrundeliegende Mechanismus dieser Untergruppe in der MSC-Therapie bei Krankheiten unbekannt. Es ist notwendig, BAMBI-hoheMFGE8-hohe UC-MSCs in Bezug auf ihren Phänotyp, ihren Metabolismus und ihre Funktion zu isolieren und weiter zu untersuchen, um die Natur dieser MSC-Untergruppe vollständig zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung^der BAMBI-High-MFGE8-High-Subpopulation aus humanen UC-MSCs. Die Subpopulation der UC-MSCs wird durch durchflusszytometrische Sortierung mit zwei Oberflächenmarkern, BAMBI und MFGE8, markiert. Die isolierten Zellen werden kultiviert und durch Durchflusszytometrie verifiziert. Die spezifischen Gene, die in den^BAMBI-hohenMFGE8-hohen UC-MSCs exprimiert werden, werden mittels RT-qPCR identifiziert. Dieses Protokoll führt zu einer hocheffizienten und reinen Zellsortierung und beschreibt die Markerprofile der BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs.

Einleitung

Humane mesenchymale Stroma-/Stammzellen (MSCs) sind somatische Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich in Osteozyten, Adipozyten, Chondrozyten und andere Zelltypen zu differenzieren¹. MSCs wurden zuerst aus dem Knochenmark isoliert und stammen weitgehend aus der Nabelschnur, dem Fettgewebe und anderen Geweben². Da UC-MSCs leicht zu beschaffen sind und eine geringe Immunogenität und immunsuppressive Wirkung aufweisen, werden sie in klinischen Studien häufig zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt ^3,4,5. Obwohl die MSC-Therapie ein vielversprechendes Potenzial für die Behandlung von Krankheiten zeigt, sind die therapeutischen Wirkungen bei den Individuen uneinheitlich⁶. Der Grund für die Instabilität der MSC-Therapie ist jedoch noch unklar.

Molekulare Fluktuationen, Morphologie, Differenzierungsfähigkeit und therapeutische Funktion bilden die Heterogenität der MSC. Einige Studien haben auch postuliert, dass MSCs Subpopulationen mit unterschiedlichen Funktionen darstellen ^7,8 und die MSC-Heterogenität mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq^{) untersucht9,10}. Die Ergebnisse zeigten, dass humane UC-MSCs unterschiedliche Subpopulationen mit spezifischen transkriptomischen Merkmalen aufweisen, während es nur wenigen Studien gelungen ist, sogenannte MSC-Subpopulationen zu isolieren. Zuvor haben wir humane UC-MSCs anhand ihrer Signaturen mittels scRNA-seq und bioinformatischer Analyse in drei Untergruppen zerlegt, wobei die BAMBI-Subpopulation^{mit hohem}MFGE8-hohem UC-MSC-Gehalt weiter gereinigt und funktionell getestet wurde¹¹. Diese Untergruppe konnte die Lupusnephritis jedoch nicht lindern. Daher ist es notwendig, die therapeutische Wirkung von BAMBI^hochMFGE8^hoch MSCs bei anderen Erkrankungen zu testen, um ihre authentischen Funktionen zu verstehen.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierung^{der BAMBI high}MFGE8 high Subgruppe aus humanen UC-MSCs mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) mittels Durchflusszytometrie und die Eigenschaften^{der BAMBI high}MFGE8 high Subgruppe.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki von 1989 durchgeführt und von der Ethikkommission des Affiliated Drum Tower Hospital der Nanjing University Medical School genehmigt (Zulassungsnummer: 202019701). Menschliche Nabelschnüre wurden von gesunden Müttern am Affiliated Drum Tower Hospital der Nanjing University Medical School nach natürlichen Wehen gewonnen, die ihre informierte Zustimmung zu ihrer Verwendung in dieser Arbeit gaben. Primäre UC-MSCs wurden, wie bereits berichtet, aus humanen Nabelschnüren isoliert¹¹.

1. UC-MSC-Kultur und Identifizierung vor der Isolierung

1. Sobald die MSCs 70-80% Konfluenz (P0) erreichen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min bei 37 °C hinzu. Fügen Sie dann 9 ml vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 × g , um die Zellen zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie das entsprechende vollständige Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen in jeder Schale werden in drei T75-Kolben (P1) überführt und in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
2. Nachdem Sie die UC-MSCs 2x durch Trypsinisierung passiert haben, ernten Sie die Zellen bei P3 mit den gleichen Schritten, die in Schritt 1.1 beschrieben wurden. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Färbepuffer (1x PBS mit 2% FBS) und zählen Sie sie. Geben Sie FACS-Färbepuffer bis zu einer Endkonzentration von 5-10 × 10⁶ Zellen/ml und halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
3. Verteilen Sie 100 μL pro Röhrchen dieser Zellsuspension auf verschiedene 1,5 mL Röhrchen. Geben Sie Isotypkontrollen und FACS-Antikörper gegen CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 und HLA-DR (alle bei 1:200) bei 4 °C für 30 min in die Zellen.
4. Waschen Sie die Zellen 2x mit dem FACS-Färbepuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min. Den Überstand verwerfen und die Ausfällungen in 200 μl FACS-Färbepuffer für die durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung von MSC-Markern resuspendieren.

2. Isolierung von BAMBI-hohen MFGE8-hohen UC-MSCs durch Durchflusszytometrie

1. Kultur von UC-MSC mit einer Dichte von ca. 5-10 × 10⁶ Zellen bei der Isolierung von BAMBI-hohen MFGE8-hohen UC-MSCs. Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,5 mM EDTA, bis sie eine runde Morphologie annehmen, fügen Sie das gesamte Medium hinzu, um die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu übertragen, und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen und die Gesamtzahl der geernteten Zellen zu berechnen. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen mit der Zellsuspension bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu sammeln.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Medium auf eine Endkonzentration von 5-10 × 10⁶ Zellen/ml und halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
3. Teilen Sie die Zellen in vier 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf (nur leere Zellen; BAMBI-markierte Zellen; MFGE8-markierte Zellen; und sowohl BAMBI- als auch MFGE8-markierte Zellen).
4. Geben Sie primäre Antikörper in geeigneten Konzentrationen (MFGE8 und BAMBI, beide bei 1:100) in die Röhrchen, mischen Sie die Zellen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die markierten Zellen einmal mit 1x PBS und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300×g. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Medium, fügen Sie den Zellen konjugierte fluoreszierende Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647, alle im Verhältnis 1:1.000) hinzu, mischen Sie die Zellen und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
6. Waschen Sie die markierten Zellen einmal mit 1x PBS, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl vollständigem Medium, filtrieren Sie durch ein 70-μm-Zellsieb, um Klumpen und Ablagerungen zu entfernen, und überführen Sie das Filtrat in ein 15-ml-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Sortierung.
7. Führen Sie das leere Zellröhrchen ohne Zugabe eines Antikörpers (Negativkontrolle) durch und passen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) an, um die Skala der negativen Population mit Antikörperfärbung zu begrenzen.
8. Führen Sie die einzelnen Antikörper-markierten Zellröhrchen (d. h. MFGE8 + Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 488 oder BAMBI + Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H&L Alexa Fluor 647) als Gating-Kontrolle aus, um zu bestimmen, wo die Positivität im Diagramm beginnt.
9. Führen Sie die Versuchsprobenröhrchen aus, um die BAMBI-Population mit^{hohem MFGE8-Gehalt} zu sortieren und zu sammeln.
10. Tellern Sie die sortierten BAMBI^highMFGE8^high MSCs in eine 24-Well-Platte und kultivieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C und 5% CO₂.
11. Wenn die sortierten^{BAMBI high}MFGE8 high MSCs zwei Passagen lang gewachsen sind, um genügend Zellen zu erhalten, dissoziieren Sie die Zellen und führen Sie eine Nachsortieranalyse durch, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie sicherzustellen, wie in den Schritten 2.1 bis 2.9 beschrieben. Alternativ kann die Reinheit der sortierten Zellen mit konventioneller Immunfluoreszenz gegen humane BAMBI- und MFGE8-Expression untersucht werden, wenn die Anzahl der gesammelten Zellen zu gering ist.

3. Charakterisierung^{der BAMBI high} MFGE8 high MSCs

1. Züchten Sie die sortierten BAMBI^highMFGE8^high MSCs in einer 12-Well-Platte, untersuchen Sie ihre Zellmorphologie unter dem Mikroskop und vergleichen Sie sie mit der von unsortierten MSCs.
   HINWEIS: Im Allgemeinen wachsen BAMBI-Zellen^{mit hohem MFGE8-Gehalt} schneller als unsortierte UC-MSCs.
2. Wenn die Zellen zu etwa 90 % in der 12-Well-Platte konfluiert sind, aspirieren Sie das Zellkulturmedium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und geben Sie 500 μl RNA-Extraktionsreagenz zu den Zellen. Schütteln Sie die Platte langsam bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
3. Pipettieren Sie das Gemisch und geben Sie es in ein RNase- und DNase-freies Röhrchen. Fügen Sie 100 μl Chloroform hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und schütteln Sie die Mischung kräftig, indem Sie sie 15 s lang vortexen. Lassen Sie die Röhre dann 3 Minuten lang bei RT stehen.
4. Das Röhrchen 15 min lang bei 11.000 × g und 4 °C zentrifugieren.
5. Übertragen Sie ca. 200 μl der oberen wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen. Geben Sie die gleiche Menge Isopropanol hinzu und pipettieren Sie mehrmals gründlich auf und ab. Lassen Sie die Mischung dann 10 Minuten bei RT stehen.
6. 15 min bei 11.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
7. Geben Sie 500 μl 75%iges Ethanol in das Pellet in der Tube und drehen Sie die Tube mehrmals vorsichtig um.
8. Das Röhrchen 5 min lang bei 6.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Zentrifugation einmal für 10 s bei 6.000 × g, saugen Sie die restliche Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette ab und trocknen Sie das Röhrchen bei RT.
9. Fügen Sie 10 μl RNase-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen, und messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
10. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Erststrang-cDNA aus bis zu 1 μg Gesamt-RNA zu synthetisieren.
11. Verwenden Sie ein qPCR-Kit, um die Genexpression gemäß den Anweisungen des Herstellers nachzuweisen und zu quantifizieren.
    HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten DNA-Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Expressionsprofile der Zelloberflächenmarker von humanen UC-MSCs. Kultivierte MSCs waren stark positiv für die CD44-, CD73-, CD90- und CD105-Expression und negativ für die CD14-, CD34-, CD45-, CD79- und HLA-DR-Expression. Die BAMBI-hohen MFGE8-hohen MSCs wurden aus kultivierten humanen UC-MSCs sortiert und ihre BAMBI- und MFGE8-Expression wurde nach einer Expansion über 3-4 Passagen mittels Durchflusszytometrie erneut analysiert (

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie die BAMBI-Subpopulation^{mit hohem}MFGE8-Gehalt aus humanen UC-MSCs isoliert und angereichert werden kann. Die Methode ist wichtig für die weitere Untersuchung der Morphologie, des Wachstums und der Funktion dieser MSC-Untergruppe. Einige Schritte sind entscheidend für die erfolgreiche Isolierung und hohe Ausbeute von BAMBI-Zellen^{mit hohem}MFGE8-Gehalt.

Erstens, der kritischste technisc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111