Выделение мезенхимальных стромальных клеток человеческого BAMBIс высоким уровнемMFGE8

Резюме

Выделение^МСК с^{высоким уровнем}MFGE8 BAMBI, одной из трех основных подгрупп, составляющих гетерогенные МСК человека с высоким уровнем MFGE8, полезно для полного понимания характеристик и функций этого подтипа для его будущего применения для повышения клинической эффективности при конкретных заболеваниях. Здесь мы представляем метод сортировки BAMBI^{с высоким MFGE8высоким} UC-MSCs.

Аннотация

Полученные из пуповины мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (ЯК-МСК) обладают низкой иммуногенностью и мощными иммуномодулирующими эффектами при лечении различных заболеваний. ЯК-МСК человека представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из трех основных субпопуляций с различной формой клеток, скоростью пролиферации, дифференцировочными способностями и иммунными регуляторными функциями. Ранее было обнаружено, что BAMBI^{с высоким уровнем}MFGE8^{и высоким} уровнем ЯК-МСК, первая подгруппа, успешно выделенная из ЯК-МСК, не облегчают лечение волчаночного нефрита. Следовательно, функция и основной механизм этой подгруппы в терапии МСК при заболеваниях остаются неизвестными. Необходимо изолировать и дополнительно исследовать МСК с^{высоким}уровнем MFGE8 BAMBI с точки зрения их фенотипа, метаболизма и функции, чтобы полностью понять природу этой подгруппы МСК. В этом протоколе мы подробно описываем метод выделения^{субпопуляции} BAMBI^{с высоким уровнем}MFGE8 от UC-MSC человека. Субпопуляция UC-MSCs мечется двумя поверхностными маркерами, BAMBI и MFGE8, с помощью сортировки проточной цитометрией. Выделенные клетки культивируются и верифицируются с помощью анализа проточной цитометрии. Специфические гены, экспрессируемые в МСК с^{высоким}уровнем MFGE8 BAMBI, идентифицируются с помощью ОТ-кПЦР. Этот протокол приводит к высокоэффективной и чистой сортировке клеток и описывает маркерные профили BAMBI^{с высоким MFGE8и высоким} уровнем UC-MSCs.

Введение

Мезенхимальные стромальные/стволовые клетки человека (МСК) являются соматическими предшественниками, способными дифференцироваться в остеоциты, адипоциты, хондроциты и другие типы клеток¹. МСК были впервые выделены из костного мозга и широко распространены из пуповины, жировой ткани и других тканей². Поскольку ЯК-МСК легко получают и проявляют низкую иммуногенность и иммуносупрессивное действие, они широко применяются в клинических испытаниях для лечения различных заболеваний ^3,4,5. Несмотря на то, что терапия МСК демонстрирует многообещающий потенциал в лечении заболеваний, терапевтические эффекты неодинаковы у разных людей⁶. Однако причина нестабильности терапии МСК до сих пор неясна.

Молекулярные флуктуации, морфология, дифференцировочная способность и терапевтическая функция составляют гетерогенность МСК. В некоторых исследованиях также постулируется, что МСК представляют собой субпопуляции с различными функциями ^7,8, и изучается гетерогенность МСК с помощью секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq)^9,10. Результаты показали, что ЯК-МСК человека имеют различные субпопуляции со специфическими транскриптомными особенностями, в то время как в немногих исследованиях были успешно выделены так называемые субпопуляции МСК. Ранее мы препарировали человеческие UC-MSC на три подгруппы в соответствии с их сигнатурами с помощью scRNA-seq и биоинформатического анализа, в котором субпопуляция BAMBI^{с высоким MFGE8и высоким} уровнем UC-MSC была дополнительно очищена и^{функционально протестирована}. Тем не менее, этой подгруппе не удалось облегчить волчаночный нефрит. Таким образом, необходимо проверить терапевтические эффекты^{МСК с высоким}MFGE8 BAMBI при других расстройствах, чтобы понять их подлинные функции.

В этом протоколе описаны методы выделения^{подгруппы высокого уровня}MFGE8 BAMBI из МСК человека с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS) с помощью проточной цитометрии, а также^{характеристики подгруппы} высокого уровня MFGE8 с^{высоким}уровнем BAMBI.

протокол

Это исследование было проведено в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации 1989 года и одобренными Комитетом по этике в аффилированной больнице Drum Tower Медицинской школы Нанкинского университета (номер одобрения: 202019701). Человеческие пуповины были получены от здоровых матерей в больнице Аффилированной башни Драм Тауэр Медицинской школы Нанкинского университета после естественных родов, которые дали свое информированное согласие на их использование в этой работе. Первичные ЯК-МСК были выделены из пуповины человека, как сообщалось ранее¹¹.

1. Бактериологическое исследование и идентификация ЯК-МСК перед изоляцией

1. Как только МСК достигнут 70-80% конфлюенции (P0), промойте клетки PBS один раз и добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 2 минут при 37 °C. Затем добавьте 9 мл готовой среды для нейтрализации трипсина, перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут для сбора клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте соответствующую полноценную среду для ресуспендирования клеток. Перенесите клетки из каждой чашки в три колбы T75 (P1) и культивируйте в клеточном инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
2. После 2-кратного пассирования UC-MSCs с помощью трипсинизации, в точке P3, соберите клетки с помощью тех же этапов, которые описаны в шаге 1.1. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в буфере для окрашивания FACS (1x PBS, содержащий 2% FBS) и подсчитайте их. Добавьте окрашивающий буфер FACS до конечной концентрации 5-10 ×^{10 6} клеток/мл и держите клеточную суспензию на льду.
3. Распределите по 100 мкл на пробирку этой клеточной суспензии в разные пробирки по 1,5 мл. Добавьте контроль изотипа и антитела FACS против CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR (все в соотношении 1:200) в клетки при 4 °C в течение 30 минут.
4. Промойте ячейки 2 раза с помощью буфера для окрашивания FACS и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать преципитаты в 200 мкл окрашивающего буфера FACS для анализа проточной цитометрии с целью выявления маркеров МСК.

2. Выделение BAMBI^{с высоким уровнем} MFGE8^{и высоким} уровнем UC-MSCs методом проточной цитометрии

1. Культивирование UC-MSC до плотности примерно 5-10 × 10⁶ клеток при выделении^{BAMBI с высоким MFGE8высоким} UC-MSCs. Диссоциируйте клетки 0,5 мМ ЭДТА в течение 5 мин до тех пор, пока они не начнут иметь круглую морфологию, добавьте всю среду для переноса клеток в коническую трубку объемом 15 мл и несколько раз пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз для получения одноклеточной суспензии. Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток и расчета общего количества собранных клеток. Центрифугируйте коническую пробирку с клеточной суспензией при 300 × г в течение 5 мин для сбора клеток.
2. Ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды до конечной концентрации 5-10 ×^{10 6} клеток/мл и держите клеточную суспензию на льду.
3. Разделите ячейки на четыре микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (только пустые ячейки; BAMBI-меченые клетки; MFGE8-меченые клетки; и клетки, меченные BAMBI и MFGE8).
4. Добавьте первичные антитела в соответствующих концентрациях (MFGE8 и BAMBI, оба в соотношении 1:100) в пробирки, перемешайте и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут.
5. Промойте помеченные клетки один раз 1x PBS и центрифугируйте при 300×г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл готовой среды, добавьте в клетки конъюгированные флуоресцентные вторичные антитела (козий антикроличий IgG H&L Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647, все в концентрации 1: 1000), перемешайте и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
6. Промойте помеченные ячейки один раз с помощью 1x PBS, как описано в шаге 2.5. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл готовой среды, отфильтруйте через клеточный фильтр 70 мкм для удаления комков и мусора и перенесите фильтрат в пробирку объемом 15 мл для сортировки проточной цитометрии.
7. Запустите пробирку с пустыми клетками без добавления антител (отрицательный контроль) и отрегулируйте прямое рассеяние (FSC) и боковое рассеяние (SSC), чтобы увеличить масштаб отрицательной популяции с помощью окрашивания антителами.
8. Запустите клеточные пробирки, меченные одним антителом (например, MFGE8 + козий антикролиацкий IgG H&L Alexa Fluor 488 или BAMBI + козий антикролик IgG H&L Alexa Fluor 647) в качестве контроля стробирования, чтобы определить, где начинается положительный результат на участке.
9. Запустите пробирку с экспериментальным образцом для сортировки и сбора популяции^{клеток с высоким уровнем}MFGE8 BAMBI.
10. Отсортированные^МСК BAMBI^{с высоким содержанием}MFGE8 в 24-луночный планшет и культивируйте клетки в клеточном инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
11. Когда отсортированные^МСК BAMBI^{с высоким уровнем}MFGE8 выросли в течение двух пассажей для получения достаточного количества клеток, диссоциируйте клетки и проведите постсортировочный анализ, чтобы обеспечить чистоту отсортированных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии, как описано в шагах 2.1-2.9. В качестве альтернативы можно исследовать чистоту отсортированных клеток с помощью обычной иммунофлюоресценции против экспрессии BAMBI человека и MFGE8, если количество собранных клеток слишком мало.

3. Характеристика^{высоких} МСК BAMBI^MFGE8

1. Выращивайте отсортированные МСК с^{высоким содержанием}MFGE8^BAMBI в 12-луночном планшете, изучайте их клеточную морфологию под микроскопом и сравнивайте ее с морфологией несортированных МСК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, клетки с^{высоким содержанием}MFGE8 BAMBI растут быстрее, чем несортированные UC-МСК.
2. Когда клетки слились примерно на 90% в 12-луночном планшете, аспирируйте среду для культивирования клеток, промойте клетки один раз 1x PBS и добавьте в клетки 500 мкл реагента для экстракции РНК. Медленно встряхивайте тарелку при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
3. Пипеткой нанесите смесь и переложите ее в пробирку, не содержащую РНКазы и ДНКазы. Добавьте 100 μл хлороформа, закройте пробирку крышкой и энергично встряхивайте смесь, вортексируя в течение 15 с. Затем дайте трубке постоять при температуре RT в течение 3 минут.
4. Центрифугируйте пробирку в течение 15 минут при 11 000 × г и 4 °C.
5. Перелейте примерно 200 мкл верхнего водного слоя в новую пробирку. Добавьте одинаковый объем изопропанола и тщательно пипеткой вверх и вниз несколько раз. Затем дайте смеси постоять при RT в течение 10 минут.
6. Центрифугируйте в течение 15 минут при 11 000 × g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
7. Добавьте 500 μL 75% этанола в гранулу в пробирке и осторожно переверните трубку несколько раз.
8. Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 6 000 × g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите центрифугирование один раз в течение 10 с при 6 000 × g, осторожно отасуньте оставшуюся жидкость с помощью пипетки и высушите пробирку при RT.
9. Добавьте 10 мкл воды, не содержащей РНКазы, чтобы растворить гранулу РНК, и измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
10. Следуйте инструкциям производителя для синтеза кДНК первой цепи из общего количества РНК до 1 мкг.
11. Используйте набор для количественной ПЦР для обнаружения и количественной оценки экспрессии генов в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности используемых ДНК-праймеров перечислены в Таблице 1.

Результаты

На рисунке 1 показаны профили экспрессии маркеров клеточной поверхности ЯК-МСК человека. Культивируемые МСК были сильно положительными в отношении экспрессии CD44, CD73, CD90 и CD105 и отрицательными в отношении экспрессии CD14, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR. ^МСК с^высо...

Обсуждение

В этом протоколе описывается, как изолировать и обогатить субпопуляцию BAMBI^{с высоким уровнем}MFGE8 из UC-MSC человека. Метод важен для дальнейшего изучения морфологии, роста и функции этой подгруппы МСК. Некоторые этапы жизненно важны для успешной изоляции и^п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111