Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBIhumanoMFGE8alto

Resumo

O isolamento de MSCs^altasde MFGE8^BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs.

Resumo

As células-tronco estromais/tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSCs) apresentam baixa imunogenicidade e potentes efeitos imunomoduladores para o tratamento de várias doenças. As UC-MSCs humanas são uma população heterogênea que consiste em três subpopulações principais com diferentes formas celulares, taxas de proliferação, habilidades de diferenciação e funções reguladoras imunológicas. Anteriormente, descobriu-se que as UC-MSCs^{BAMBI altas}MFGE8, o primeiro subgrupo isolado com sucesso das UC-MSCs, não aliviavam a nefrite lúpica. Portanto, a função e o mecanismo subjacente desse subgrupo na terapia com MSC para doenças permanecem desconhecidos. É necessário isolar e investigar ainda mais as CTMs^altasde MFGE8^em termos de fenótipo, metabolismo e função para entender completamente a natureza desse subgrupo de CTMs. Neste protocolo, descrevemos um método detalhado para isolar a subpopulação alta^deMFGE8^BAMBI de UC-MSCs humanas. A subpopulação de UC-MSCs é marcada com dois marcadores de superfície, BAMBI e MFGE8, por classificação por citometria de fluxo. As células isoladas são cultivadas e verificadas por análise de citometria de fluxo. Os genes específicos expressos nas CTMs^{de UC altas}de MFGE8^de BAMBI são identificados por RT-qPCR. Este protocolo resulta em uma classificação de células altamente eficiente e pura e descreve os perfis de marcadores das BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs.

Introdução

As células-tronco estromais/tronco mesenquimais humanas (CTMs) são progenitores somáticos capazes de se diferenciar em osteócitos, adipócitos, condrócitos e outros tipos de células¹. As CTMs foram isoladas pela primeira vez da medula óssea e são amplamente derivadas do cordão umbilical, tecido adiposo e outros tecidos². Como as UC-MSCs são facilmente obtidas e exibem baixa imunogenicidade e efeitos imunossupressores, elas são amplamente aplicadas em ensaios clínicos para tratar várias doenças ^3,4,5. Embora a terapia com CTM mostre potencial promissor para o tratamento de doenças, os efeitos terapêuticos são inconsistentes entre os indivíduos⁶. No entanto, a razão para a instabilidade da terapia com MSC ainda não está clara.

Flutuações moleculares, morfologia, capacidade de diferenciação e função terapêutica compreendem a heterogeneidade das CTMs. Alguns estudos também postularam que as MSCs constituem subpopulações com diferentes funções ^7,8 e exploraram a heterogeneidade das MSC por meio do sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ^{9 , 10} . Os resultados revelaram que as UC-MSCs humanas têm subpopulações distintas com características transcriptômicas específicas, enquanto poucos estudos isolaram com sucesso as chamadas subpopulações de MSC. Anteriormente, dissecamos UC-MSCs humanas em três subgrupos de acordo com suas assinaturas por meio de scRNA-seq e análise de bioinformática, nos quais a subpopulação BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC foi purificada e testada funcionalmente¹¹. No entanto, esse subgrupo não conseguiu aliviar a nefrite lúpica. Assim, é necessário testar os efeitos terapêuticos das CTMs^altasde MFGE8^de BAMBI em outros distúrbios para entender suas funções autênticas.

Este protocolo descreve métodos para isolar o subgrupo BAMBI^altoMFGE8^alto de UC-MSCs humanas por meio de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) por citometria de fluxo e as características do subgrupo^{BAMBI alto}MFGE8 alto.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1989 e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Drum Tower Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (número de aprovação: 202019701). Os cordões umbilicais humanos foram obtidos de mães saudáveis no Hospital Afiliado Drum Tower da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing após o parto natural, que deram seu consentimento informado para seu uso neste trabalho. As CTMs-UC primárias foram isoladas de cordões umbilicais humanos, conforme relatado anteriormente¹¹.

1. Cultura e identificação de UC-MSC antes do isolamento

1. Quando as MSCs atingirem 70-80% de confluência (P0), lave as células uma vez com PBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% por 2 min a 37 ° C. Em seguida, adicione 9 mL de meio completo para neutralizar a tripsina, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min para coletar as células. Rejeitar o sobrenadante e adicionar o meio completo adequado para ressuspender as células. Transferir as células de cada placa para três frascos T75 (P1) e cultivar numa estufa de células a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Depois de passar as UC-MSCs 2x por tripsinização, em P3, colha as células pelas mesmas etapas descritas na etapa 1.1. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células no tampão de coloração FACS (1x PBS contendo 2% de FBS) e conte-as. Adicione o tampão de coloração FACS a uma concentração final de 5-10 × 10⁶ células/mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
3. Distribua 100 μL por tubo desta suspensão celular em diferentes tubos de 1,5 mL. Adicione controles de isotipo e anticorpos FACS contra CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR (todos a 1:200) às células a 4 ° C por 30 min.
4. Lave as células 2x com o tampão de coloração FACS e centrifugue a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os precipitados em 200 μL de tampão de coloração FACS para análise de citometria de fluxo para identificar marcadores MSC.

2. Isolamento de BAMBI^alto MFGE8^alto UC-MSCs por citometria de fluxo

1. Cultive UC-MSC a uma densidade de aproximadamente 5-10 × 10⁶ células ao isolar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs. Dissocie as células com EDTA 0,5 mM por 5 min até que comecem a ter uma morfologia redonda, adicione o meio completo para transferir as células para um tubo cônico de 15 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes para preparar uma suspensão unicelular. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e calcular o número total de células colhidas. Centrifugar o tubo cónico com a suspensão celular a 300 × g durante 5 min para recolher as células.
2. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo até uma concentração final de 5-10 × 10⁶ células / mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
3. Divida as células em quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (somente células em branco; Células marcadas com BAMBI; Células marcadas com MFGE8; e células marcadas com BAMBI e MFGE8).
4. Adicione anticorpos primários em concentrações apropriadas (MFGE8 e BAMBI, ambos a 1:100) aos tubos, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 min.
5. Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS e centrifugue a 300×g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo, adicione anticorpos secundários fluorescentes conjugados (cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, todos a 1: 1.000) às células, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro.
6. Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS, conforme descrito na etapa 2.5. Ressuspenda as células em 500 μL de meio completo, filtre através de um filtro de células de 70 μm para eliminar aglomerados e detritos e transfira o filtrado para um tubo de 15 mL para classificação por citometria de fluxo.
7. Execute o tubo celular em branco sem adicionar um anticorpo (controle negativo) e ajuste a dispersão direta (FSC) e a dispersão lateral (SSC) para bloquear a escala da população negativa com coloração de anticorpos.
8. Execute os tubos celulares marcados com anticorpos únicos (ou seja, MFGE8 + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488, ou BAMBI + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 647) como um controle de gating para determinar onde a positividade começa na parcela.
9. Execute o(s) tubo(s) de amostra experimental(is) para classificar e coletar a população^{de células altas de alto}MFGE8 do BAMBI.
10. Coloque as MSCs BAMBI^altasMFGE8^altas classificadas em uma placa de 24 poços e cultive as células em uma incubadora de células a 37 ° C e 5% de CO₂.
11. Quando as MSCs^{altas de}MFGE8 BAMBI classificadas crescerem por duas passagens para obter células suficientes, dissocie as células e execute uma análise pós-classificação para garantir a pureza das populações de células classificadas por citometria de fluxo, conforme descrito nas etapas 2.1-2.9. Alternativamente, examine a pureza das células classificadas com imunofluorescência convencional contra a expressão humana de BAMBI e MFGE8 se o número de células coletadas for muito pequeno.

3. Caracterização das CTMs^altas de MFGE8^BAMBI

1. Cultive as MSCs^{BAMBI altas}MFGE8^em uma placa de 12 poços, examine sua morfologia celular ao microscópio e compare-as com a de MSCs não classificadas.
   NOTA: Em geral, as células^{altas de}MFGE8 BAMBI crescem mais rápido do que as UC-MSCs não classificadas.
2. Quando as células estiverem aproximadamente 90% confluentes na placa de 12 poços, aspire o meio de cultura celular, lave as células uma vez com 1x PBS e adicione 500 μL de reagente de extração de RNA às células. Agite o prato lentamente à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
3. Pipete a mistura e transfira-a para um tubo livre de RNase e DNase. Adicione 100 μL de clorofórmio, tampe o tubo e agite a mistura vigorosamente por vórtice por 15 s. Em seguida, deixe o tubo em repouso por 3 min.
4. Centrifugar o tubo durante 15 min a 11.000 × g e 4 °C.
5. Transferir cerca de 200 μL da camada aquosa superior para um novo tubo. Adicione o mesmo volume de isopropanol e pipete completamente para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, deixe a mistura repousar em RT por 10 min.
6. Centrifugue por 15 min a 11.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante.
7. Adicione 500 μL de etanol a 75% ao pellet no tubo e inverta o tubo suavemente várias vezes.
8. Centrifugue o tubo por 5 min a 6.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante. Repita a centrifugação uma vez por 10 s a 6.000 × g, aspire cuidadosamente o fluido restante com pipeta e seque o tubo em RT.
9. Adicione 10 μL de água livre de RNase para dissolver o pellet de RNA e meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro.
10. Siga as instruções do fabricante para sintetizar o cDNA de primeira fita de até 1 μg de RNA total.
11. Use um kit qPCR para detectar e quantificar a expressão gênica, de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: As sequências dos primers de DNA usados estão listadas na Tabela 1.

Resultados

A Figura 1 mostra os perfis de expressão de marcadores de superfície celular de UC-MSCs humanas. As MSCs cultivadas foram fortemente positivas para a expressão de CD44, CD73, CD90 e CD105 e negativas para a expressão de CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. As MSCs^altasde MFGE8^BAMBI foram classificadas de UC-MSCs humanas cultivadas, e sua expressão de BAMBI e MFGE8 foi reanalisada por citometria de fluxo após expansão por 3-4 passagen...

Discussão

Este protocolo descreve como isolar e enriquecer a subpopulação alta^deMFGE8^BAMBI de UC-MSCs humanas. O método é importante para um estudo mais aprofundado da morfologia, crescimento e função deste subgrupo de MSC. Algumas etapas são vitais para o isolamento bem-sucedido e alto rendimento de células^{BAMBI altas}MFGE8 altas.

Primeiro, o aspecto técnico mais crítico a ser considerado é o uso de uma solução de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111