Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBIhumain

Résumé

L’isolement^{des CSM} BAMBI^{à haute}MFGE8, l’un des trois principaux sous-groupes constituant les CSM-UC humaines hétérogènes, est utile pour bien comprendre les caractéristiques et les fonctions de ce sous-type en vue de son application future pour améliorer l’efficacité clinique dans des maladies spécifiques. Nous présentons ici une méthode de tri des UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8.

Résumé

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical (UC-MSCs) présentent une faible immunogénicité et de puissants effets immunomodulateurs pour le traitement de diverses maladies. Les CSM-UC humaines sont une population hétérogène composée de trois sous-populations principales avec des formes cellulaires, des taux de prolifération, des capacités de différenciation et des fonctions de régulation immunitaire différents. Auparavant, les UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8 high, le premier sous-groupe isolé avec succès des UC-MSC, n’ont pas réussi à soulager la néphrite lupique. Par conséquent, la fonction et le mécanisme sous-jacent de ce sous-groupe dans le traitement des CSM pour les maladies restent inconnus. Il est nécessaire d’isoler et d’étudier plus en détail les CSM-UC^élevées de BAMBI^entermes de phénotype, de métabolisme et de fonction pour comprendre complètement la nature de ce sous-groupe de CSM. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode détaillée pour isoler la sous-population^{BAMBI high}MFGE8 high des UC-MSC humaines. La sous-population de CSM-UC est marquée avec deux marqueurs de surface, BAMBI et MFGE8, par tri par cytométrie en flux. Les cellules isolées sont cultivées et vérifiées par analyse par cytométrie en flux. Les gènes spécifiques exprimés dans les^CSM-UC élevées de BAMBI^àMFGE8 élevés sont identifiés par RT-qPCR. Ce protocole permet un tri cellulaire très efficace et pur et décrit les profils de marqueurs des UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8^high.

Introduction

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines (CSM) sont des progéniteurs somatiques capables de se différencier en ostéocytes, adipocytes, chondrocytes et autres types de cellules¹. Les CSM ont d’abord été isolées dans la moelle osseuse et sont largement dérivées du cordon ombilical, du tissu adipeux et d’autres tissus². Parce que les UC-MSC sont faciles à obtenir et présentent une faible immunogénicité et des effets immunosuppresseurs, elles sont largement appliquées dans les essais cliniques pour traiter diverses maladies ^3,4,5. Bien que la thérapie MSC montre un potentiel prometteur pour le traitement des maladies, les effets thérapeutiques sont incohérents entre les individus⁶. Cependant, la raison de l’instabilité du traitement par CSM n’est pas encore claire.

Les fluctuations moléculaires, la morphologie, la capacité de différenciation et la fonction thérapeutique constituent l’hétérogénéité des CSM. Certaines études ont également postulé que les CSM constituent des sous-populations ayant des fonctions différentes ^7,8 et ont exploré l’hétérogénéité des CSM via le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq)^9,10. Les résultats ont révélé que les CSM-UC humaines ont des sous-populations distinctes avec des caractéristiques transcriptomiques spécifiques, alors que peu d’études ont réussi à isoler ce que l’on appelle les sous-populations de CSM. Nous avons précédemment disséqué les UC-MSC humaines en trois sous-groupes en fonction de leurs signatures via le scRNA-seq et l’analyse bioinformatique, dans laquelle la sous-population BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC a été purifiée et testée fonctionnellement¹¹. Cependant, ce sous-groupe n’a pas réussi à atténuer la néphrite lupique. Ainsi, il est nécessaire de tester les effets thérapeutiques de BAMBI^highMFGE8^{high MSCs} dans d’autres troubles pour comprendre leurs fonctions authentiques.

Ce protocole décrit les méthodes d’isolement^{du sous-groupe} BAMBI^HighMFGE8 high à partir des UC-MSC humaines par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) par cytométrie en flux et les caractéristiques du sous-groupe BAMBI^highMFGE8^high.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki de 1989 et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital affilié Drum Tower de la faculté de médecine de l’Université de Nanjing (numéro d’approbation : 202019701). Des cordons ombilicaux humains ont été obtenus de mères en bonne santé à l’hôpital Affiliate Drum Tower de la faculté de médecine de l’Université de Nanjing après un travail naturel, qui ont donné leur consentement éclairé pour leur utilisation dans ce travail. Des CSM-UC primaires ont été isolées dans les cordons ombilicaux humains, comme indiqué précédemment¹¹.

1. Culture et identification de l’UC-MSC avant l’isolement

1. Une fois que les CSM atteignent 70-80 % de confluence (P0), lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 2 min à 37 °C. Ensuite, ajoutez 9 ml de milieu complet pour neutraliser la trypsine, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes pour recueillir les cellules. Jetez le surnageant et ajoutez le milieu complet approprié pour remettre les cellules en suspension. Transvaser les cellules de chaque boîte dans trois flacons T75 (P1) et les faire cultiver dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Après avoir passé les UC-MSCs 2x par trypsinisation, à P3, récoltez les cellules en suivant les mêmes étapes que celles décrites à l’étape 1.1. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le tampon de coloration FACS (1x PBS contenant 2 % de FBS) et comptez-les. Ajouter le tampon de coloration FACS à une concentration finale de 5-10 ×^10-6 cellules/mL et maintenir la suspension cellulaire sur de la glace.
3. Répartissez 100 μL par tube de cette suspension cellulaire dans différents tubes de 1,5 mL. Ajoutez des contrôles d’isotypes et des anticorps FACS contre CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA-DR (tous à 1:200) dans les cellules à 4 °C pendant 30 min.
4. Lavez les cellules 2 fois avec le tampon de coloration FACS et centrifugez-les à 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les précipités en suspension dans 200 μL de tampon de coloration FACS pour une analyse par cytométrie en flux afin d’identifier les marqueurs MSC.

2. Isolement des CSM-UC^{BAMBI à haute} MFGE8^élevée par cytométrie en flux

1. Cultivez des UC-MSC à une densité d’environ 5-10 × 10⁶ cellules en isolant^des UC-MSC^{BAMBI à haute}MFGE8. Dissociez les cellules avec 0,5 mM d’EDTA pendant 5 min jusqu’à ce qu’elles commencent à avoir une morphologie ronde, ajoutez le milieu complet pour transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL, et pipetez la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois pour préparer une suspension unicellulaire. Utilisez 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules et calculer le nombre total de cellules récoltées. Centrifuger le tube conique avec la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min pour collecter les cellules.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet jusqu’à une concentration finale de 5 à 10 × 10 à⁶ cellules/mL et maintenir la suspension cellulaire sur de la glace.
3. Divisez les cellules dans quatre tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (cellules vides seulement ; cellules marquées BAMBI ; cellules marquées MFGE8 ; et les cellules marquées BAMBI et MFGE8).
4. Ajouter des anticorps primaires à des concentrations appropriées (MFGE8 et BAMBI, tous deux à 1:100) dans les tubes, mélanger et incuber les cellules à température ambiante pendant 15 min.
5. Lavez une fois les cellules marquées avec 1x PBS et centrifugez à 300×g pendant 5 min. Jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet, ajoutez des anticorps secondaires fluorescents conjugués (IgG H&L de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, tous à 1:1 000) aux cellules, mélangez et incubez les cellules à température ambiante pendant 15 min dans l’obscurité.
6. Lavez une fois les cellules marquées avec 1x PBS, comme décrit à l’étape 2.5. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu complet, filtrer à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour éliminer les amas et les débris, et transférer le filtrat dans un tube de 15 mL pour le tri par cytométrie en flux.
7. Faites fonctionner le tube de cellules vierges sans ajouter d’anticorps (contrôle négatif) et ajustez la diffusion vers l’avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour bloquer l’échelle de la population négative avec la coloration des anticorps.
8. Exécutez les tubes cellulaires marqués d’un seul anticorps (c’est-à-dire MFGE8 + IgG H&L anti-lapin Alexa Fluor 488, ou BAMBI + IgG H&L Alexa Fluor 647 anti-lapin pour chèvre) comme contrôle de contrôle pour déterminer où commence la positivité dans la parcelle.
9. Exécutez le(s) tube(s) d’échantillon expérimental pour trier et collecter la^{population cellulaire BAMBI high}MFGE8.
10. Plaquez les CSM triées BAMBI^highMFGE8^high dans une plaque à 24 puits et cultivez les cellules dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.
11. Lorsque^{les CSM} triées BAMBI^{à haute}MFGE8 se sont développées sur deux passages pour obtenir suffisamment de cellules, dissociez les cellules et effectuez une analyse post-tri pour garantir la pureté des populations cellulaires triées par cytométrie en flux, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.9. Vous pouvez également examiner la pureté des cellules triées par immunofluorescence conventionnelle par rapport à l’expression humaine de BAMBI et MFGE8 si le nombre de cellules collectées est trop faible.

3. Caractérisation des CSM^hautes MFGE8^de BAMBI

1. Cultivez^{les CSM} BAMBI^{à haute}MFGE8 triées dans une plaque à 12 puits, examinez leur morphologie cellulaire au microscope et comparez-les à celle des CSM non triées.
   REMARQUE : En général,^{les cellules} BAMBI^{à haute}MFGE8 se développent plus rapidement que les UC-MSC non triées.
2. Lorsque les cellules sont confluentes à environ 90 % dans la plaque à 12 puits, aspirez le milieu de culture cellulaire, lavez les cellules une fois avec 1x PBS et ajoutez 500 μL de réactif d’extraction d’ARN aux cellules. Agitez lentement la plaque à température ambiante (RT) pendant 5 min.
3. Pipetez le mélange et transférez-le dans un tube sans RNase ni DNase. Ajouter 100 μL de chloroforme, boucher le tube et agiter vigoureusement le mélange en tourbillonnant pendant 15 s. Ensuite, laissez le tube reposer à RT pendant 3 min.
4. Centrifugez le tube pendant 15 min à 11 000 × g et 4 °C.
5. Transférez environ 200 μL de la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajoutez le même volume d’isopropanol et pipetez soigneusement de haut en bas plusieurs fois. Ensuite, laissez le mélange reposer à RT pendant 10 min.
6. Centrifugeuse pendant 15 min à 11 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant.
7. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 75 % dans le tube et retournez doucement le tube plusieurs fois.
8. Centrifugez le tube pendant 5 min à 6 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant. Répétez la centrifugation une fois pendant 10 s à 6 000 × g, aspirez soigneusement le liquide restant à l’aide d’une pipette et séchez le tube à RT.
9. Ajoutez 10 μL d’eau exempte de RNase pour dissoudre la pastille d’ARN et mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
10. Suivez les instructions du fabricant pour synthétiser l’ADNc premier brin à partir d’un maximum de 1 μg d’ARN total.
11. Utilisez un kit qPCR pour détecter et quantifier l’expression des gènes, selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les séquences des amorces d’ADN utilisées sont énumérées dans le tableau 1.

Résultats

La figure 1 montre les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire des CSM-UC humaines. Les CSM en culture étaient fortement positives pour l’expression de CD44, CD73, CD90 et CD105 et négatives pour l’expression de CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA-DR. Les^{CSM BAMBI à haute}MFGE8 ont été triées à partir de CSU-UC humaines cultivées, et leur expression de BAMBI et MFGE8 a été réanalysée par cytométrie en flux a...

Discussion

Ce protocole décrit comment isoler et enrichir la sous-population^{BAMBI high}MFGE8 high à partir de UC-MSCs humaines. La méthode est importante pour l’étude plus approfondie de la morphologie, de la croissance et de la fonction de ce sous-groupe MSC. Certaines étapes sont essentielles pour la réussite de l’isolement et le rendement élevé^{des cellules} BAMBI^{à haute}MFGE8.

Tout d’abord, l’aspect technique l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111