בידוד של תאי סטרומה מזנכימלייםשמקורםבחבל הטבור גבוה BAMBI גבוה MFGE8

Summary

הבידוד^{של MSCs גבוהים}MFGE8 של BAMBI, אחת משלוש תת-הקבוצות העיקריות המרכיבות UC-MSCs אנושיים הטרוגניים, מסייע להבנה מלאה של המאפיינים והפונקציות של תת-סוג זה ליישום עתידי שלו לשיפור היעילות הקלינית במחלות ספציפיות. כאן, אנו מציגים שיטה למיון BAMBI^גבוהMFGE8 UC-MSCs.

Abstract

תאי סטרומל/גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור (UC-MSCs) מציגים אימונוגניות נמוכה והשפעות אימונומודולטוריות חזקות לטיפול במחלות שונות. UC-MSCs אנושיים הם אוכלוסייה הטרוגנית המורכבת משלוש תת-אוכלוסיות עיקריות עם צורות תאים שונות, שיעורי התפשטות, יכולות התמיינות ותפקודי ויסות חיסוני. בעבר, נמצא כי BAMBI^HighMFGE8^High UC-MSCs, תת-הקבוצה הראשונה שבודדה בהצלחה מ-UC-MSCs, לא הצליחה להקל על דלקת כליות זאבת. לפיכך, התפקוד והמנגנון הבסיסי של תת-קבוצה זו בטיפול MSC במחלות נותר לא ידוע. יש צורך לבודד ולחקור עוד יותר את ה-UC-MSCs^{הגבוהים}של BAMBI MFGE8 במונחים של הפנוטיפ, חילוף החומרים והתפקוד שלהם כדי להבין לחלוטין את האופי של תת-קבוצת MSC זו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד תת-האוכלוסייה^הגבוההשל BAMBI MFGE8 מ-UC-MSCs אנושיים. תת-האוכלוסייה של UC-MSCs מסומנת בשני סמני שטח, BAMBI ו-MFGE8, על ידי מיון ציטומטריית זרימה. התאים המבודדים מתורבתים ומאומתים על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. הגנים הספציפיים המתבטאים ב-BAMBI^highMFGE8 high-MSCs מזוהים על ידי RT-qPCR. פרוטוקול זה מביא למיון תאים יעיל וטהור ביותר ומתאר את פרופילי הסמנים של ה-UC-MSCs^{הגבוהים}של BAMBI MFGE8^גבוהים.

Introduction

תאי סטרומל/גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs) הם אבות סומטיים המסוגלים להתמיין לאוסטאוציטים, אדיפוציטים, כונדרוציטים וסוגי תאים אחרים¹. MSCs בודדו לראשונה ממח העצם והם נגזרים באופן נרחב מחבל הטבור, רקמת השומן ורקמות אחרות². מכיוון ש-UC-MSCs מושגים בקלות ומציגים אימונוגניות נמוכה והשפעות מדכאות חיסון, הם מיושמים באופן נרחב בניסויים קליניים לטיפול במחלות שונות ^3,4,5. למרות שטיפול MSC מראה פוטנציאל מבטיח לטיפול במחלות, ההשפעות הטיפוליות אינן עקביות בקרב אנשים⁶. עם זאת, הסיבה לחוסר היציבות בטיפול MSC עדיין לא ברורה.

תנודות מולקולריות, מורפולוגיה, יכולת התמיינות ותפקוד טיפולי מהווים הטרוגניות של MSC. כמה מחקרים גם הניחו כי MSCs מהווים תת-אוכלוסיות בעלות פונקציות שונות ^7,8 וחקרו הטרוגניות של MSC באמצעות ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq)^9,10. התוצאות חשפו כי ל-UC-MSCs אנושיים יש תת-אוכלוסיות נפרדות עם מאפיינים טרנסקריפטומיים ספציפיים, בעוד שמחקרים מעטים בודדו בהצלחה את מה שנקרא תת-אוכלוסיות MSC. בעבר ניתחנו UC-MSCs אנושיים לשלוש תת-קבוצות על פי חתימותיהם באמצעות scRNA-seq וניתוח ביואינפורמטיקה, שבו תת-אוכלוסיית BAMBI^גבוההMFGE8^UC-MSC גבוהה טוהרה עוד יותר ונבדקה תפקודית¹¹. עם זאת, תת-קבוצה זו לא הצליחה להקל על דלקת כליות זאבת. לפיכך, יש צורך לבדוק את ההשפעות הטיפוליות^{של MSCs גבוהים}MFGE8 של BAMBI בהפרעות אחרות כדי להבין את התפקודים האותנטיים שלהם.

פרוטוקול זה מתאר שיטות לבידוד תת-הקבוצה^הגבוההשל BAMBI MFGE8 מ-UC-MSCs אנושיים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) על ידי ציטומטריית זרימה ואת המאפיינים של תת-הקבוצה ^הגבוההשל BAMBI MFGE8.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1989 ואושר על ידי ועדת האתיקה בבית החולים המסונף למגדל התוף של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת נאנג'ינג (מספר אישור: 202019701). חבל הטבור האנושי הושג מאמהות בריאות בבית החולים המסונף למגדל התוף של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת נאנג'ינג לאחר לידה טבעית, שנתנו את הסכמתן מדעת לשימוש בהם בעבודה זו. UC-MSCs ראשוניים בודדו מחבל הטבור האנושי כפי שדווח בעבר¹¹.

1. תרבית UC-MSC וזיהוי לפני בידוד

1. לאחר שה-MSCs מגיעים למפגש של 70-80% (P0), שטפו את התאים פעם אחת עם PBS והוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 9 מ"ל של מדיום שלם כדי לנטרל את הטריפסין, העביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו את המדיום השלם המתאים כדי להשהות מחדש את התאים. מעבירים את התאים בכל מנה לשלוש צלוחיות T75 (P1) ותרבית בחממת תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
2. לאחר מעבר UC-MSCs פי 2 באמצעות טריפסיניזציה, ב-P3, קצרו את התאים באמצעות אותם שלבים המתוארים בשלב 1.1. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים במאגר צביעה FACS (1x PBS המכיל 2% FBS) וספרו אותם. הוסף מאגר צביעה FACS לריכוז סופי של 5-10 × 10⁶ תאים/מ"ל ושמור את תרחיף התאים על קרח.
3. מחלקים 100 מיקרוליטר לכל צינור של תרחיף תאים זה לצינורות שונים של 1.5 מ"ל. הוסף בקרות איזוטיפ ונוגדני FACS כנגד CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 ו-HLA-DR (כולם ב-1:200) לתאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. שטפו את התאים פעמיים עם מאגר הצביעה והצנטריפוגה של FACS בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו את המשקעים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה FACS לניתוח ציטומטריית זרימה לזיהוי סמני MSC.

2. בידוד של BAMBI^High MFGE8^High UC-MSCs על ידי ציטומטריית זרימה

1. תרבית UC-MSC לצפיפות של כ-5-10 ×-10⁶ תאים בעת בידוד BAMBI^גבוהMFGE8 UC-MSCs. נתק את התאים עם EDTA של 0.5 מ"מ למשך 5 דקות עד שהם מתחילים לקבל מורפולוגיה עגולה, הוסף את המדיום השלם כדי להעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל, והעבר את תרחיף התא למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להכין תרחיף של תא בודד. השתמש ב-10 מיקרוליטר של תרחיף התאים כדי לספור את התאים ולחשב את המספר הכולל של התאים שנקטפו. צנטריפוגה של הצינור החרוטי עם תרחיף התאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
2. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם לריכוז סופי של 5-10 ×-10⁶ תאים/מ"ל ושמרו על תרחיף התאים על קרח.
3. חלקו את התאים לארבעה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (תאים ריקים בלבד; תאים עם תווית BAMBI; תאים עם תווית MFGE8; ותאים המסומנים ב-BAMBI ו-MFGE8).
4. הוסף נוגדנים ראשוניים בריכוזים מתאימים (MFGE8 ו-BAMBI, שניהם ב-1:100) לצינורות, ערבב ודגירה על התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
5. שטפו את התאים המסומנים פעם אחת עם 1x PBS, וצנטריפוגה בחום של 300× גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם, הוסיפו נוגדנים משניים פלואורסצנטיים מצומדים (IgG H&L Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 647, כולם ב-1:1,000) לתאים, ערבבו ודגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך.
6. שטפו את התאים המסומנים פעם אחת עם 1x PBS, כמתואר בשלב 2.5. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום שלם, סננו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לחסל גושים ופסולת, והעבירו את המסנן לצינור של 15 מ"ל למיון זרימה ציטומטרית.
7. הפעל את צינור התא הריק מבלי להוסיף נוגדן (בקרה שלילית) והתאם את הפיזור קדימה (FSC) ופיזור הצד (SSC) כדי להגדיר את קנה המידה של האוכלוסייה השלילית עם צביעת נוגדנים.
8. הפעל את צינורות התא היחידים המסומנים בנוגדנים (כלומר, MFGE8 + עז נגד ארנב IgG H&L Alexa Fluor 488, או BAMBI + עז נגד ארנב IgG H&L Alexa Fluor 647) כבקרת שער כדי לקבוע היכן מתחילה החיוביות בעלילה.
9. הפעל את צינורות הדגימה הניסיוניים כדי למיין ולאסוף את אוכלוסיית התאים^הגבוההשל BAMBI MFGE8.
10. צלחו את ה-MSCs ^{הגבוהים} של BAMBI^HighMFGE8 בצלחת של 24 בארות וטפחו את התאים בחממת תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.
11. כאשר ה-MSCs^{הגבוהים} של BAMBI^HighMFGE8 גדלו במשך שני מעברים כדי להשיג מספיק תאים, לנתק את התאים ולבצע ניתוח לאחר המיון כדי להבטיח את טוהר אוכלוסיות התאים הממוינות על ידי ציטומטריית זרימה, כמתואר בשלבים 2.1-2.9. לחלופין, בדוק את טוהר התאים הממוינים עם אימונופלואורסצנציה קונבנציונלית כנגד ביטוי BAMBI ו-MFGE8 אנושי אם מספר התאים שנאספו קטן מדי.

3. אפיון ה-MSCs^{הגבוהים} של BAMBI MFGE8

1. גדל את ה-MSCs^{הגבוהים} של BAMBI^HighMFGE8 הממוינים בצלחת של 12 בארות, בחן את מורפולוגיה התאים שלהם במיקרוסקופ והשווה אותם לזו של MSCs לא ממוינים.
   הערה: באופן כללי, תאים^גבוהים של BAMBI^עםMFGE8 גדלים מהר יותר מאשר UC-MSCs לא ממוינים.
2. כאשר התאים מתכנסים בכ-90% בצלחת 12 הבארות, יש לשאוב את מדיום תרבית התאים, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA לתאים. נענע את הצלחת לאט בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
3. פיפטו את התערובת והעבירו אותה לצינור נטול RNase ו-DNase. מוסיפים 100 מיקרוליטר כלורופורם, מכסים את הצינור ומנערים את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך 15 שניות. לאחר מכן, אפשר לצינור לעמוד ב-RT למשך 3 דקות.
4. צנטריפוגה את הצינור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 11,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
5. העבירו כ -200 מיקרוליטר מהשכבה המימית העליונה לצינור חדש. הוסף את אותו נפח של איזופרופנול ופיפטה ביסודיות למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, הניחו לתערובת לעמוד ב-RT למשך 10 דקות.
6. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-11,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
7. הוסף 500 מיקרוליטר של 75% אתנול לגלולה בצינור והפוך את הצינור בעדינות מספר פעמים.
8. צנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות בטמפרטורה של 6,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. חזור על הצנטריפוגה פעם אחת למשך 10 שניות בטמפרטורה של 6,000 × גרם, שאב בזהירות את הנוזל הנותר באמצעות פיפטה וייבש את הצינור ב-RT.
9. הוסף 10 מיקרוליטר מים נטולי RNase כדי להמיס את כדור ה-RNA, ומדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
10. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לסנתז cDNA גדיל ראשון מעד 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
11. השתמש בערכת qPCR כדי לזהות ולכמת ביטוי גנים, בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: הרצפים של פריימרים ה-DNA המשמשים מפורטים בטבלה 1.

תוצאות

איור 1 מציג את פרופילי ביטוי סמני פני התא של UC-MSCs אנושיים. MSCs מתורבתים היו חיוביים מאוד לביטוי CD44, CD73, CD90 ו-CD105 ושליליים לביטוי CD14, CD34, CD45, CD79 ו-HLA-DR. ה-MSCs^{הגבוהים}של BAMBI MFGE8 מוינו מ-UC-MSCs אנושיים מתורבתים, וביטוי ה-BAMBI וה-MFGE8 שלהם נותח מחדש על ידי ציטומטריית זרי...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד ולהעשיר את תת-האוכלוסייה^הגבוההשל BAMBI MFGE8 מ-UC-MSCs אנושיים. השיטה חשובה להמשך מחקר של המורפולוגיה, הצמיחה והתפקוד של תת-קבוצת MSC זו. שלבים מסוימים חיוניים לבידוד מוצלח ותפוקה גבוהה של תאים^גבוהים של BAMBI^MFGE8.

ראש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111