İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Özet

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Umbilikal kord kaynaklı mezenkimal stromal/kök hücreler (UC-MSC'ler), çeşitli hastalıkların tedavisinde düşük immünojenisite ve güçlü immünomodülatör etkiler gösterir. İnsan UC-MSC'leri, farklı hücre şekillerine, proliferasyon oranlarına, farklılaşma yeteneklerine ve bağışıklık düzenleyici işlevlere sahip üç ana alt popülasyondan oluşan heterojen bir popülasyondur. Daha önce, UC-MSC'lerden başarılı bir şekilde izole edilen ilk alt grup olan BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'lerin lupus nefritini hafifletmede başarısız olduğu bulunmuştu. Bu nedenle, hastalıklar için MSC tedavisinde bu alt grubun işlevi ve altta yatan mekanizması bilinmemektedir. Bu MSC alt grubunun doğasını tam olarak anlamak için BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'leri fenotipleri, metabolizmaları ve işlevleri açısından izole etmek ve daha fazla araştırmak gerekir. Bu protokolde, BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek alt popülasyonunu insan UC-MSC'lerinden izole etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. UC-MSC'lerin alt popülasyonu, akış sitometrisi sıralaması ile BAMBI ve MFGE8 olmak üzere iki yüzey markörü ile etiketlenir. İzole edilen hücreler kültürlenir ve akış sitometrisi analizi ile doğrulanır. BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'lerde eksprese edilen spesifik genler RT-qPCR ile tanımlanır. Bu protokol, yüksek verimli ve saf hücre sıralaması ile sonuçlanır ve BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'lerin işaretleyici profillerini tanımlar.

Giriş

İnsan mezenkimal stromal/kök hücreleri (MSC'ler), osteositlere, adipositlere, kondrositlere ve diğer hücre tiplerine farklılaşabilen somatik progenitörlerdir¹. MSC'ler ilk olarak kemik iliğinden izole edildi ve yaygın olarak göbek kordonu, yağ dokusu ve diğer dokulardan türetildi². UC-MSC'ler kolayca elde edilebildiğinden ve düşük immünojenisite ve immünosüpresif etkiler sergilediğinden, çeşitli hastalıkları tedavi etmek için klinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmaktadır ^3,4,5. MSC tedavisi hastalıkların tedavisi için umut verici bir potansiyel gösterse de, terapötik etkiler bireyler arasında tutarsızdır⁶. Bununla birlikte, MSC tedavisinin instabilitesinin nedeni hala belirsizdir.

Moleküler dalgalanmalar, morfoloji, farklılaşma kapasitesi ve terapötik fonksiyon MSC heterojenliğini oluşturur. Bazı çalışmalar ayrıca MSC'lerin farklı işlevlere sahip alt popülasyonlar oluşturduğunu^{varsaymıştır 7,8} ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) yoluyla MSC heterojenliğini ^{araştırmıştır9,10}. Sonuçlar, insan UC-MSC'lerinin spesifik transkriptomik özelliklere sahip farklı alt popülasyonlara sahip olduğunu, oysa az sayıda çalışmanın MSC alt popülasyonları olarak adlandırılan alt popülasyonları başarılı bir şekilde izole ettiğini ortaya koymuştur. Daha önce, BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC alt popülasyonunun daha fazla saflaştırıldığı ve işlevsel olarak test edildiği scRNA-seq ve biyoinformatik analiz yoluyla insan UC-MSC'lerini imzalarına göre üç alt gruba ayırdık¹¹. Bununla birlikte, bu alt grup lupus nefritini hafifletemedi. Bu nedenle, gerçek işlevlerini anlamak için BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'lerin terapötik etkilerini diğer bozukluklarda test etmek gerekir.

Bu protokol, akış sitometrisi ve BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek alt grubunun özellikleri ile floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) yoluyla insan UC-MSC'lerinden izole edilme yöntemlerini ve BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek alt grubunun özelliklerini açıklar.

Protokol

Bu çalışma, 1989 Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun olarak yürütülmüş ve Nanjing Üniversitesi Tıp Fakültesi Bağlı Drum Tower Hastanesi'ndeki Etik Kurul tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 202019701). İnsan göbek kordonları, Nanjing Üniversitesi Tıp Fakültesi Bağlı Drum Tower Hastanesi'ndeki sağlıklı annelerden, doğal doğum eyleminden sonra elde edildi ve bu çalışmada kullanılmaları için bilgilendirilmiş onamlarını verdiler. Primer UC-MSC'ler, daha önce bildirildiği gibi insan göbek kordonlarından izole edildi¹¹.

1. İzolasyon öncesi UC-MSC kültürü ve tanımlaması

1. MSC'ler% 70-80 birleşmeye (P0) ulaştığında, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Daha sonra, tripsini nötralize etmek için 9 mL tam ortam ekleyin, hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri toplamak için 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için uygun tam ortamı ekleyin. Her tabaktaki hücreleri üç T75 şişesine (P1) aktarın ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir hücre inkübatöründe kültürleyin.
2. UC-MSC'leri tripsinizasyon yoluyla 2x'i geçtikten sonra, P3'te, hücreleri adım 1.1'de açıklanan adımlarla hasat edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın. FACS boyama tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin (% 2 FBS içeren 1x PBS) ve sayın. FACS boyama tamponunu 5-10 × 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
3. Bu hücre süspansiyonunun tüp başına 100 μL'sini farklı 1.5 mL'lik tüplere dağıtın. CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 ve HLA-DR'ye (tümü 1:200'de) karşı izotip kontrolleri ve FACS antikorlarını 4 ° C'de 30 dakika boyunca hücrelere ekleyin.
4. Hücreleri 2 kez FACS boyama tamponu ile yıkayın ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve MSC belirteçlerini tanımlamak için akış sitometrisi analizi için 200 μL FACS boyama tamponunda çökeltileri yeniden süspanse edin.

2. BAMBI^yüksek MFGE8^yüksek UC-MSC'lerin akış sitometrisi ile izolasyonu

1. BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek UC-MSC'leri izole ederken UC-MSC'yi yaklaşık 5-10 × 10⁶ hücre yoğunluğuna kadar kültürleyin. Hücreleri yuvarlak bir morfolojiye sahip olmaya başlayana kadar 5 dakika boyunca 0.5 mM EDTA ile ayırın, hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için tam ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için. Hücreleri saymak ve hasat edilen toplam hücre sayısını hesaplamak için 10 μL hücre süspansiyonu kullanın. Hücreleri toplamak için konik tüpü hücre süspansiyonu ile 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
2. Hücreleri 1 mL tam ortamda 5-10 × 10⁶ hücre / mL'lik nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
3. Hücreleri dört adet 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne bölün (yalnızca boş hücreler; BAMBI etiketli hücreler; MFGE8 etiketli hücreler; ve hem BAMBI hem de MFGE8 etiketli hücreler).
4. Tüplere uygun konsantrasyonlarda (MFGE8 ve BAMBI, her ikisi de 1:100'de) primer antikorlar ekleyin, karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
5. Etiketli hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın ve 300×g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin, hücrelere konjuge floresan ikincil antikorlar (keçi anti-tavşan IgG H & L Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647, hepsi 1: 1.000'de) ekleyin, karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin karanlıkta.
6. Etiketli hücreleri adım 2.5'te açıklandığı gibi 1x PBS ile bir kez yıkayın. Hücreleri 500 μL'lik tam ortamda yeniden süspanse edin, kümeleri ve kalıntıları ortadan kaldırmak için 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süzüntüyü akış sitometrisi sıralaması için 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
7. Boş hücre tüpünü bir antikor eklemeden (negatif kontrol) çalıştırın ve antikor boyama ile negatif popülasyonun ölçeğini geçmek için ileri saçılmayı (FSC) ve yan saçılmayı (SSC) ayarlayın.
8. Pozitifliğin grafiğin neresinde başladığını belirlemek için tek antikor etiketli hücre tüplerini (yani, MFGE8 + keçi tavşan önleyici IgG H & L Alexa Fluor 488 veya BAMBI + keçi anti-tavşan IgG H & L Alexa Fluor 647) geçit kontrolü olarak çalıştırın.
9. BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek hücre popülasyonunu sıralamak ve toplamak için deneysel numune tüplerini çalıştırın.
10. Sıralanmış BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'leri 24 oyuklu bir plakada plakalayın ve hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir hücre inkübatöründe yetiştirin.
11. Sıralanan BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'ler, yeterli hücre elde etmek için iki geçiş boyunca büyüdüğünde, hücreleri ayırın ve adım 2.1-2.9'da açıklandığı gibi, akış sitometrisi ile sıralanan hücre popülasyonlarının saflığını sağlamak için bir sıralama sonrası analiz yapın. Alternatif olarak, toplanan hücre sayısı çok küçükse, insan BAMBI ve MFGE8 ekspresyonuna karşı geleneksel immünofloresan ile sıralanan hücrelerin saflığını inceleyin.

3. BAMBI^yüksek MFGE8^yüksek MSC'lerin karakterizasyonu

1. Sıralanmış BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'leri 12 oyuklu bir plakada büyütün, hücre morfolojilerini mikroskop altında inceleyin ve bunları sınıflandırılmamış MSC'lerinkiyle karşılaştırın.
   NOT: Genel olarak, BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek hücreleri, sınıflandırılmamış UC-MSC'lerden daha hızlı büyür.
2. Hücreler 12 oyuklu plakada yaklaşık% 90 birleştiğinde, hücre kültürü ortamını aspire edin, hücreleri bir kez 1x PBS ile yıkayın ve hücrelere 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika yavaşça çalkalayın.
3. Karışımı pipetleyin ve RNaz ve DNaz içermeyen bir tüpe aktarın. 100 μL kloroform ekleyin, tüpü kapatın ve karışımı 15 saniye boyunca girdaplayarak kuvvetlice çalkalayın. Ardından, tüpün 3 dakika boyunca RT'de durmasına izin verin.
4. Tüpü 11.000 × g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
5. Üst sulu tabakanın yaklaşık 200 μL'sini yeni bir tüpe aktarın. Aynı hacimde izopropanol ekleyin ve birkaç kez iyice yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, karışımın 10 dakika RT'de beklemesine izin verin.
6. 11.000 × g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
7. Tüpteki pelete 500 μL %75 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin.
8. Tüpü 6.000 × g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Santrifüjlemeyi 6.000 × g'da 10 saniye boyunca bir kez tekrarlayın, kalan sıvıyı pipet ile dikkatlice aspire edin ve tüpü RT'de kurutun.
9. RNA peletini çözmek için 10 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
10. 1 μg'a kadar toplam RNA'dan birinci iplikli cDNA'yı sentezlemek için üreticinin talimatlarını izleyin.
11. Üreticinin talimatlarına göre gen ekspresyonunu tespit etmek ve ölçmek için bir qPCR kiti kullanın.
    NOT: Kullanılan DNA primerlerinin dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.

Sonuçlar

Şekil 1, insan UC-MSC'lerinin hücre yüzeyi işaretleyici ifade profillerini göstermektedir. Kültürlenmiş MSC'ler CD44, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonu için güçlü pozitif, CD14, CD34, CD45, CD79 ve HLA-DR ekspresyonu için negatifti. BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek MSC'leri, ekili insan UC-MSC'lerinden ayrıldı ve BAMBI ve MFGE8 ekspresyonu, 3-4 geçiş için genişlemeden sonra akış sitometrisi ile yeniden analiz edildi (

Tartışmalar

Bu protokol, BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek alt popülasyonunun insan UC-MSC'lerinden nasıl izole edileceğini ve zenginleştirileceğini açıklar. Yöntem, bu MSC alt grubunun morfolojisi, büyümesi ve işlevinin daha fazla incelenmesi için önemlidir. BAMBI^yüksekMFGE8^yüksek hücrelerinin başarılı izolasyonu ve yüksek verimi için bazı adımlar hayati önem taşır.

İlk olarak, dikkate alınması gereken en kr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111