Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

요약

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI^높은MFGE8^높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

초록

탯줄 유래 중간엽 기질/줄기세포(UC-MSC)는 다양한 질병을 치료하기 위한 낮은 면역원성과 강력한 면역 조절 효과를 나타냅니다. 인간 UC-MSC는 세포 모양, 증식 속도, 분화 능력 및 면역 조절 기능이 다른 세 가지 주요 하위 집단으로 구성된 이질적인 집단입니다. 이전에는 UC-MSC에서 성공적으로 분리된 첫 번째 하위 그룹인 BAMBI^높은MFGE8^높은 UC-MSC가 루푸스 신염을 완화하지 못하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 질병에 대한 MSC 요법에서 이 하위 그룹의 기능과 기본 메커니즘은 아직 알려지지 않았습니다. 이 MSC 하위 그룹의 특성을 완전히 이해하기 위해서는 BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs의 표현형, 대사 및 기능 측면에서 분리하고 추가 조사할 필요가 있습니다. 이 프로토콜에서는 인간 UC-MSC에서 BAMBI^높은MFGE8^높은 하위 집단을 분리하는 자세한 방법을 설명합니다. UC-MSC의 하위 모집단은 유세포 분석 분류에 의해 BAMBI 및 MFGE8의 두 가지 표면 마커로 라벨링됩니다. 분리된 세포는 유세포 분석 분석을 통해 배양 및 검증됩니다. BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs에서 발현되는 특이적 유전자는 RT-qPCR에 의해 확인된다. 이 프로토콜은 매우 효율적이고 순수한 세포 분류를 가능하게 하며 BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC의 마커 프로파일을 설명합니다.

서문

인간 중간엽 기질/줄기세포(MSC)는 골세포, 지방세포, 연골세포 및 기타 세포 유형으로 분화할 수 있는 체세포 전구세포입니다¹. MSC는 먼저 골수에서 분리되었으며 탯줄, 지방 조직 및 기타 조직에서 널리 유래되었습니다². UC-MSC는 쉽게 얻을 수 있고 면역원성이 낮고 면역억제 효과를 나타내기 때문에 다양한 질병을 치료하기 위한 임상시험에 널리 적용되고 있습니다 ^3,4,5. MSC 요법은 질병 치료에 유망한 잠재력을 보여주지만, 치료 효과는 개인에 따라 일관되지 않습니다⁶. 그러나 MSC 요법이 불안정한 이유는 아직 불분명합니다.

분자 변동, 형태, 분화 능력 및 치료 기능은 MSC 이질성을 구성합니다. 일부 연구에서는 MSC가 서로 다른 기능을 가진 하위 집단을 구성한다고 가정하고^{, 7,8} 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)^9,10을 통해 MSC 이질성을 탐구했습니다. 그 결과, 인간 UC-MSC는 특정 전사체 특징을 가진 뚜렷한 하위 집단을 가지고 있는 반면, 소위 MSC 하위 집단을 성공적으로 분리한 연구는 거의 없는 것으로 나타났습니다. 우리는 이전에 scRNA-seq 및 생물정보학 분석을 통해 인간 UC-MSC를 서명에 따라 3개의 하위 그룹으로 해부했으며, BAMBI^높은MFGE8^높은 UC-MSC 하위 집단을 추가로 정제하고 기능적으로 테스트했습니다¹¹. 그러나 이 하위 그룹은 루푸스 신염을 완화시키지 못했습니다. 따라서 BAMBI 높은 MFGE8 높은 MSC의 진정한 기능을 이해하기 위해 다른 질환에서 BAMBI^높은MFGE8^높은 MSC의 치료 효과를 테스트할 필요가 있습니다.

이 프로토콜은 유세포 분석에 의한 FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting)를 통해 인간 UC-MSC에서 BAMBI^highMFGE8^high subgroup을 분리하는 방법과 BAMBI^highMFGE8^high subgroup의 특성을 설명합니다.

프로토콜

본 연구는 1989년 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 수행되었으며, 난징대학교 의과대학 부속 드럼타워 병원 윤리위원회의 승인을 받았다(승인번호: 202019701). 인간 탯줄은 자연 분만 후 난징 대학 의과 대학의 부속 드럼 타워 병원의 건강한 어머니로부터 얻었으며,이 작업에 사용하는 것에 대해 사전 동의했습니다. 11차 UC-MSC는^{이전에 보고된} 바와 같이 인간 탯줄에서 분리되었습니다.

1. 분리 전 UC-MSC 배양 및 식별

1. MSC가 70-80% confluence(P0)에 도달하면 PBS로 세포를 한 번 세척하고 37°C에서 2분 동안 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가합니다. 그런 다음 9mL의 완전한 배지를 첨가하여 트립신을 중화하고, 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 300× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상등액을 버리고 적절한 완전한 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시킵니다. 각 접시의 세포를 3개의 T75 플라스크(P1)로 옮기고 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양기에서 배양합니다.
2. 트립신화를 통해 UC-MSC를 2x 전달한 후 P3에서 1.1단계에서 설명한 것과 동일한 단계를 통해 세포를 수확합니다. 원심분리 후 상층액을 버리십시오. FACS 염색 완충액(2% FBS를 포함하는 1x PBS)에 세포를 재현탁하고 계수합니다. FACS 염색 완충액을 최종 농도 5-10 ×^{10 6} cells/mL에 추가하고 세포 현탁액을 얼음 위에 유지합니다.
3. 이 세포 현탁액의 튜브당 100μL를 다른 1.5mL 튜브에 분배합니다. CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 및 HLA-DR(모두 1:200)에 대한 동형 대조군 및 FACS 항체를 4°C의 셀에 30분 동안 추가합니다.
4. FACS 염색 완충액과 원심분리기로 세포를 300× 5분 동안 2회 세척합니다. MSC 마커를 식별하기 위한 유세포 분석을 위해 상층액을 버리고 200μL의 FACS 염색 완충액에 침전물을 재현탁합니다.

2. 유세포 분석에 의한 BAMBI^high MFGE8^high UC-MSC 분리

1. BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC를 분리할 때 UC-MSC를 약 5-10 ×^{10 6} cells의 밀도로 배양합니다. 세포가 둥근 형태를 갖기 시작할 때까지 5분 동안 0.5mM EDTA로 세포를 해리하고, 완전한 배지를 추가하여 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 이동시킨 다음, 세포 현탁액을 위아래로 여러 번 피펫하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 세포를 계수하고 수확된 총 세포 수를 계산합니다. 세포 현탁액이 있는 원뿔형 튜브를 300 × g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
2. 1mL의 완전한 배지에 세포를 5-10 × 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 재현탁시키고 세포 현탁액을 얼음 위에 유지합니다.
3. 세포를 4개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다(빈 세포만 해당; BAMBI 표지 세포; MFGE8 표지 세포; 및 BAMBI 및 MFGE8 표지 세포).
4. 적절한 농도(MFGE8 및 BAMBI, 둘 다 1:100)의 1차 항체를 튜브에 추가하고 세포를 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.
5. 라벨링된 세포를 1x PBS로 한 번 세척하고 300×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 1mL의 완전한 배지에 세포를 재현탁시키고, 세포에 접합 형광 2차 항체(염소 항토끼 IgG H&L Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 647, 모두 1:1,000)를 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 어두운 곳에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
6. 2.5단계에서 설명한 대로 1x PBS로 라벨링된 세포를 한 번 세척합니다. 500 μL의 완전한 배지에 세포를 재현탁하고, 70 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링하여 덩어리와 파편을 제거하고, 유세포 분석을 위해 여과액을 15 mL 튜브로 옮깁니다.
7. 항체를 추가하지 않고 blank cell tube를 실행하고(negative control) 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)을 조정하여 항체 염색으로 negative population의 규모를 게이트합니다.
8. 단일 항체 표지 세포관(예: MFGE8 + 염소 항토끼 IgG H&L Alexa Fluor 488 또는 BAMBI + 염소 항토끼 IgG H&L Alexa Fluor 647)을 게이팅 대조군으로 실행하여 플롯에서 양성이 시작되는 위치를 확인합니다.
9. 실험용 샘플 튜브를 실행하여 BAMBI^highMFGE8^high cell population을 분류하고 수집합니다.
10. 분류된 BAMBI^highMFGE8^high MSCs를 24-well plate에 플레이트화하고 37°C 및 5% CO₂의 cell incubator에서 세포를 배양합니다.
11. 분류된 BAMBI^highMFGE8^high MSCs가 충분한 세포를 얻기 위해 2개의 계대에 대해 성장한 경우, 세포를 해리하고 분류 후 분석을 수행하여 2.1-2.9단계에 설명된 대로 유세포 분석으로 분류된 세포 집단의 순도를 보장합니다. 또는 수집된 세포의 수가 너무 적은 경우 human BAMBI 및 MFGE8 발현에 대한 기존 면역형광으로 분류된 세포의 순도를 검사합니다.

3. BAMBI^high MFGE8^high MSC의 특성화

1. 분류된 BAMBI^highMFGE8^high MSC를 12웰 플레이트에서 성장시키고, 현미경으로 세포 형태를 검사하고, 분류되지 않은 MSC와 비교합니다.
   참고: 일반적으로 BAMBI^highMFGE8^high cell은 정렬되지 않은 UC-MSC보다 빠르게 성장합니다.
2. 세포가 12-well 플레이트에서 약 90% 융합되면 세포 배양 배지를 흡인하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 세포에 500μL의 RNA 추출 시약을 추가합니다. 접시를 실온(RT)에서 5분 동안 천천히 흔듭니다.
3. 혼합물을 피펫팅하여 RNase 및 DNase가 없는 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 100μL를 넣고 튜브를 덮고 15초 동안 와류로 혼합물을 세게 흔듭니다. 그런 다음 튜브를 3분 동안 RT에 두십시오.
4. 튜브를 11,000 × g 및 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.
5. 약 200 μL의 상부 수성층을 새 튜브로 전달합니다. 동일한 부피의 이소프로판올과 피펫을 여러 번 위아래로 철저히 첨가합니다. 그런 다음 혼합물을 10분 동안 RT로 두십시오.
6. 11,000 × g 및 4 °C에서 15분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오.
7. 튜브의 펠릿에 500μL의 75% 에탄올을 추가하고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집습니다.
8. 튜브를 6,000 × g 및 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 6,000 × g에서 10초 동안 원심분리를 한 번 반복하고, 피펫을 통해 남은 유체를 조심스럽게 흡인하고, 상온에서 튜브를 건조시킵니다.
9. RNase가 없는 물 10μL를 첨가하여 RNA 펠릿을 용해시키고 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.
10. 제조업체의 지침에 따라 최대 1μg의 총 RNA에서 첫 번째 가닥 cDNA를 합성합니다.
11. 제조업체의 지침에 따라 qPCR 키트를 사용하여 유전자 발현을 검출하고 정량화합니다.
    주: 이용된 DNA 뇌관의 순서는 표 1에서 열거된다.

결과

그림 1은 인간 UC-MSC의 세포 표면 마커 발현 프로파일을 보여줍니다. 배양된 MSC는 CD44, CD73, CD90 및 CD105 발현에 대해 강하게 양성이었고 CD14, CD34, CD45, CD79 및 HLA-DR 발현에 대해 음성이었습니다. BAMBI^highMFGE8^high MSCs는 배양된 human UC-MSCs에서 분류하고, BAMBI 및 MFGE8 발현을 3-4 계대 확장 후 유세포 분석으로 재분석했습니다(그?...

토론

이 프로토콜은 인간 UC-MSC에서 BAMBI^높은MFGE8^높은 하위 집단을 분리하고 농축하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이 MSC 하위 그룹의 형태, 성장 및 기능에 대한 추가 연구에 중요합니다. BAMBI^highMFGE8^high cell의 성공적인 분리와 높은 수율을 위해서는 몇 가지 단계가 필수적입니다.

첫째, 고려해야 할 가장 중요한 기술적 측?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111