Isolamento di cellule stromali mesenchimali umane derivate dal cordone ombelicalead altoMFGE8

Riepilogo

L'isolamento delle MSC^alteMFGE8 di BAMBI, uno dei tre principali sottogruppi che costituiscono UC-MSC umane eterogenee, è utile per comprendere appieno le caratteristiche e le funzioni di questo sottotipo per la sua futura applicazione per migliorare l'efficacia clinica in malattie specifiche. Qui, presentiamo un metodo per lo smistamento di BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC.

Abstract

Le cellule mesenchimali stromali/staminali derivate dal cordone ombelicale (UC-MSC) presentano una bassa immunogenicità e potenti effetti immunomodulatori per il trattamento di varie malattie. Le UC-MSC umane sono una popolazione eterogenea composta da tre sottopopolazioni principali con diverse forme cellulari, tassi di proliferazione, capacità di differenziazione e funzioni di regolazione immunitaria. In precedenza, le UC-MSC^{ad alto}MFGE8^di BAMBI, il primo sottogruppo isolato con successo dalle UC-MSC, non riuscivano ad alleviare la nefrite lupica. Pertanto, la funzione e il meccanismo sottostante di questo sottogruppo nella terapia delle MSC per le malattie rimangono sconosciuti. È necessario isolare e studiare ulteriormente^le UC-MSC^{ad alto}MFGE8 di BAMBI in termini di fenotipo, metabolismo e funzione per comprendere completamente la natura di questo sottogruppo di MSC. In questo protocollo, descriviamo un metodo dettagliato per isolare la sottopopolazione^{BAMBI ad alto}MFGE8 da UC-MSC umane. La sottopopolazione di UC-MSC è marcata con due marcatori di superficie, BAMBI e MFGE8, mediante smistamento con citometria a flusso. Le cellule isolate vengono coltivate e verificate mediante analisi di citometria a flusso. I geni specifici espressi nelle UC-MSC alte MFGE8^di BAMBI^sonoidentificati mediante RT-qPCR. Questo protocollo consente di ottenere un sorting cellulare altamente efficiente e puro e descrive i profili dei marcatori^delle UC-MSC^{BAMBI ad alto}MFGE8.

Introduzione

Le cellule stromali/staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitori somatici in grado di differenziarsi in osteociti, adipociti, condrociti e altri tipi di cellule¹. Le MSC sono state isolate per la prima volta dal midollo osseo e sono ampiamente derivate dal cordone ombelicale, dal tessuto adiposo e da altri tessuti². Poiché le UC-MSC sono facilmente ottenibili e mostrano una bassa immunogenicità ed effetti immunosoppressivi, sono ampiamente applicate negli studi clinici per il trattamento di varie malattie ^3,4,5. Sebbene la terapia con MSC mostri un potenziale promettente per il trattamento delle malattie, gli effetti terapeutici sono incoerenti tra gli individui⁶. Tuttavia, il motivo dell'instabilità della terapia con MSC non è ancora chiaro.

Le fluttuazioni molecolari, la morfologia, la capacità di differenziazione e la funzione terapeutica comprendono l'eterogeneità delle MSC. Alcuni studi hanno anche postulato che le MSC costituiscano sottopopolazioni con funzioni diverse ^7,8 e hanno esplorato l'eterogeneità delle MSC tramite il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)^9,10. I risultati hanno rivelato che le UC-MSC umane hanno sottopopolazioni distinte con specifiche caratteristiche trascrittomiche, mentre pochi studi hanno isolato con successo le cosiddette sottopopolazioni di MSC. In precedenza abbiamo sezionato le UC-MSC umane in tre sottogruppi in base alle loro firme tramite scRNA-seq e analisi bioinformatiche, in cui la sottopopolazione di BAMBI^{ad alto}MFGE8^{UC-MSC è} stata ulteriormente purificata e testata funzionalmente¹¹. Tuttavia, questo sottogruppo non è riuscito ad alleviare la nefrite lupica. Pertanto, è necessario testare gli effetti terapeutici delle MSC^alteMFGE8 di BAMBI in altri disturbi per comprendere le loro funzioni autentiche.

Questo protocollo descrive i metodi per isolare il sottogruppo^{BAMBI high}MFGE8 high da UC-MSC umane tramite smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) mediante citometria a flusso e le caratteristiche del sottogruppo^{BAMBI high}MFGE8 high.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1989 e approvato dal Comitato Etico presso l'Ospedale Affiliato Drum Tower della Nanjing University Medical School (numero di approvazione: 202019701). I cordoni ombelicali umani sono stati ottenuti da madri sane presso l'Affiliated Drum Tower Hospital della Nanjing University Medical School dopo il travaglio naturale, che hanno dato il loro consenso informato per il loro uso in questo lavoro. Le UC-MSC primarie sono state isolate dal cordone ombelicale umano, come precedentemente riportato¹¹.

1. Coltura e identificazione delle UC-MSC prima dell'isolamento

1. Una volta che le MSC raggiungono il 70-80% di confluenza (P0), lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% per 2 minuti a 37 °C. Quindi, aggiungere 9 mL di terreno completo per neutralizzare la tripsina, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti per raccogliere le cellule. Scartare il surnatante e aggiungere il terreno completo appropriato per risospendere le cellule. Trasferire le cellule in ciascuna piastra in tre fiasche T75 (P1) e la coltura in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Dopo aver fatto passare le UC-MSC 2x tramite tripsinizzazione, a P3, raccogliere le cellule attraverso gli stessi passaggi descritti nel passaggio 1.1. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere le cellule nel tampone di colorazione FACS (1x PBS contenente il 2% di FBS) e contarle. Aggiungere il tampone di colorazione FACS a una concentrazione finale di 5-10 × 10⁶ cellule/mL e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
3. Distribuire 100 μl per provetta di questa sospensione cellulare in diverse provette da 1,5 mL. Aggiungere controlli isotipici e anticorpi FACS contro CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR (tutti a 1:200) alle cellule a 4 °C per 30 minuti.
4. Lavare le cellule 2 volte con il tampone di colorazione FACS e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere i precipitati in 200 μL di tampone di colorazione FACS per l'analisi della citometria a flusso per identificare i marcatori MSC.

2. Isolamento di UC-MSC alte MFGE8^di BAMBI^mediante citometria a flusso

1. Coltura di UC-MSC a una densità di circa 5-10 × 10⁶ cellule durante l'isolamento di BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs. Dissociare le cellule con EDTA 0,5 mM per 5 minuti fino a quando iniziano ad avere una morfologia rotonda, aggiungere il terreno completo per trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e pipettare la sospensione cellulare su e giù più volte per preparare una sospensione a cellula singola. Utilizzare 10 μl di sospensione cellulare per contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule raccolte. Centrifugare la provetta conica con la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti per raccogliere le cellule.
2. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo fino a una concentrazione finale di 5-10 × 10⁶ cellule/mL e mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
3. Dividere le cellule in quattro provette per microcentrifuga da 1,5 mL (solo celle vuote; cellule marcate con BAMBI; celle marcate con MFGE8; e cellule marcate con BAMBI e MFGE8).
4. Aggiungere anticorpi primari a concentrazioni appropriate (MFGE8 e BAMBI, entrambi a 1:100) alle provette, mescolare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti.
5. Lavare una volta le cellule marcate con 1x PBS e centrifugare a 300×g per 5 minuti. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo, aggiungere anticorpi secondari fluorescenti coniugati (IgG H&L Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 di capra anti-coniglio, tutti a 1:1.000) alle cellule, mescolare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti al buio.
6. Lavare una volta le celle marcate con 1x PBS, come descritto al punto 2.5. Risospendere le cellule in 500 μL di terreno completo, filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per eliminare grumi e detriti e trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL per lo smistamento della citometria a flusso.
7. Far scorrere la provetta di cellule vuote senza aggiungere un anticorpo (controllo negativo) e regolare la dispersione diretta (FSC) e la dispersione laterale (SSC) per superare la scala della popolazione negativa con la colorazione anticorpale.
8. Esegui le singole provette cellulari marcate con anticorpi (ad esempio, MFGE8 + IgG H&L Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio, o BAMBI + IgG ANTI-CONIGLIO DI CAPRA H&L Alexa Fluor 647) come controllo di gating per determinare dove inizia la positività nel grafico.
9. Eseguire le provette del campione sperimentale per ordinare e raccogliere la popolazione cellulare^{BAMBI ad alto}MFGE8.
10. Placcare le MSC BAMBI^highMFGE8^high in una piastra a 24 pozzetti e coltivare le cellule in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO₂.
11. Quando le MSC BAMBI^highMFGE8^selezionate sono cresciute per due passaggi per ottenere un numero sufficiente di cellule, dissociare le cellule ed eseguire un'analisi post-selezione per garantire la purezza delle popolazioni cellulari selezionate mediante citometria a flusso, come descritto nei passaggi 2.1-2.9. In alternativa, esaminare la purezza delle cellule selezionate con l'immunofluorescenza convenzionale rispetto all'espressione umana di BAMBI e MFGE8 se il numero di cellule raccolte è troppo piccolo.

3. Caratterizzazione delle^alte MSC di BAMBI^{ad alto} MFGE8

1. Coltiva le MSC BAMBI^highMFGE8^selezionate in una piastra a 12 pozzetti, esamina la loro morfologia cellulare al microscopio e confrontale con quella delle MSC non selezionate.
   NOTA: In generale, le cellule ad^altoMFGE8 di BAMBI crescono più velocemente delle UC-MSC non selezionate.
2. Quando le cellule sono confluenti per circa il 90% nella piastra a 12 pozzetti, aspirare il terreno di coltura cellulare, lavare le cellule una volta con 1x PBS e aggiungere 500 μL di reagente di estrazione dell'RNA alle cellule. Agitare lentamente la piastra a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
3. Pipettare la miscela e trasferirla in una provetta priva di RNasi e DNasi. Aggiungere 100 μl di cloroformio, tappare la provetta e agitare energicamente la miscela agitando per 15 s. Quindi, lasciare che il tubo rimanga in RT per 3 minuti.
4. Centrifugare la provetta per 15 minuti a 11.000 × g e 4 °C.
5. Trasferire circa 200 μl dello strato acquoso superiore in una nuova provetta. Aggiungere lo stesso volume di isopropanolo e pipettare accuratamente su e giù più volte. Quindi, lasciare riposare il composto a RT per 10 minuti.
6. Centrifugare per 15 minuti a 11.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante.
7. Aggiungere 500 μl di etanolo al 75% al pellet nella provetta e capovolgere delicatamente la provetta più volte.
8. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 6.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante. Ripetere la centrifugazione una volta per 10 s a 6.000 × g, aspirare con cura il liquido rimanente tramite pipetta e asciugare la provetta a RT.
9. Aggiungere 10 μL di acqua priva di RNasi per sciogliere il pellet di RNA e misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
10. Seguire le istruzioni del produttore per sintetizzare il cDNA del primo filamento fino a 1 μg di RNA totale.
11. Utilizzare un kit qPCR per rilevare e quantificare l'espressione genica, secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Le sequenze dei primer di DNA utilizzati sono elencate nella Tabella 1.

Risultati

La Figura 1 mostra i profili di espressione dei marcatori di superficie cellulare delle UC-MSC umane. Le MSC in coltura erano fortemente positive per l'espressione di CD44, CD73, CD90 e CD105 e negative per l'espressione di CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. Le MSC^alte di BAMBI^MFGE8sono state selezionate da UC-MSC umane coltivate e la loro espressione di BAMBI e MFGE8 è stata rianalizzata mediante citometria a flusso dopo l'espansione pe...

Discussione

Questo protocollo descrive come isolare e arricchire la sottopopolazione^{BAMBI high}MFGE8 high da UC-MSC umane. Il metodo è importante per ulteriori studi sulla morfologia, la crescita e la funzione di questo sottogruppo di MSC. Alcuni passaggi sono fondamentali per il successo dell'isolamento e l'elevata resa^{delle celle} BAMBI^{ad alto}MFGE8.

In primo luogo, l'aspetto tecnico più critico da considerare è l'uso di una s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 μm cell strainer	Falcon	352350	Dilution: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Dilution: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Dilution: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Dilution: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Dilution: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Dilution: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Dilution: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Dilution: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Dilution: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Dilution: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Dilution: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Dilution: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Dilution: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Dilution: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Dilution: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Dilution: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Dilution: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111