Reconstitución individualizada de la microbiota de la leche materna: un enfoque factible en entornos reales

Resumen

El artículo describe un protocolo para reconstituir la microbiota láctea pasteurizada de donante a partir de la propia microbiota láctea materna en entornos prácticos y reales. Demuestra un crecimiento bacteriano y una modulación del microbioma eficaces, lo que respalda la aplicación factible de este procedimiento dentro de la atención rutinaria de un hospital de maternidad y su banco de leche humana asociado.

Resumen

La leche materna (MOM) es el recurso nutricional más completo para los recién nacidos. En los casos en que las madres no pueden producir suficiente leche o no pueden amamantar, la alternativa preferida es la leche humana pasteurizada de donante (MDP), que los bancos de leche humana proporcionan de forma rutinaria. El PDM ofrece una gama superior de elementos nutricionales e inmunológicos en comparación con cualquier fórmula disponible en el mercado. Sin embargo, para garantizar la bioseguridad, el PDM se somete a la pasteurización, un proceso que inactiva la microbiota comensal y reduce ciertos compuestos bioactivos. Este estudio presenta un protocolo diseñado para restaurar la microbiota de PDM utilizando MOM como fuente microbiana, adaptando el enfoque a un entorno clínico real.

El protocolo se implementó en un ensayo clínico realizado en un hospital de maternidad y su banco de leche humana asociado, con el objetivo de proporcionar leche personalizada de donante a recién nacidos prematuros cuyas madres no pueden producir suficiente leche. La metodología consiste en inocular PDM con 10% de MOM, seguido de incubación a 37 °C durante 4 h. Los análisis microbiológicos demostraron un crecimiento bacteriano exitoso en la leche inoculada (IM) después de la incubación, con un perfil de microbiota de la leche reconstituida (RM) muy similar al de MOM, lo que indica una restauración eficaz de la microbiota. Estos resultados sugieren que el protocolo de reconstitución es factible para su implementación en la atención neonatal, con el potencial de mejorar la calidad nutricional e inmunológica de la MDP, apoyando así la salud y el desarrollo de los recién nacidos no amamantados.

Introducción

La leche materna es ampliamente reconocida como la mejor fuente de nutrición para los recién nacidos, ya que proporciona no solo macro y micronutrientes esenciales, sino también una compleja gama de elementos, incluidos varios metabolitos y componentes del sistema inmunitario, como anticuerpos, citocinas^y células. Además, las propiedades beneficiosas de la leche materna también surgen de una comunidad de microorganismos comensales. Todos estos elementos de la leche materna juegan un papel crucial en el desarrollo del recién nacido¹. La comunidad de microorganismos, conocida como microbiota, está influenciada por una combinación de factores como la dieta, el estilo de vida materno, el tipo de parto y la edad gestacional, lo que da como resultado que cada leche tenga una microbiota con características particulares². Los mecanismos por los que la microbiota de la leche materna beneficia el desarrollo neonatal van desde la protección de la superficie entérica mediante la colonización por bacterias comensales hasta la promoción de la maduración del sistema inmunitario mediante la producción de metabolitos que interactúan con las células inmunitarias del intestino³. Por esta razón, el perfil individualizado de microorganismos en la leche de cada madre la convierte en una forma de medicina personalizada para los recién nacidos⁴.

La presencia de una microbiota sana puede ayudar a proteger al recién nacido contra la colonización por microorganismos potencialmente patógenos, ocupando el nicho ecológico y favoreciendo la nutrición, especialmente en el caso de los prematuros, que son más vulnerables a estos impactos externos debido a que se encuentran en un entorno hospitalario y tienen un sistema inmunitario inmaduro. Además, las madres que dan a luz prematuramente a menudo tienen dificultades para producir leche en cantidades suficientes para sus recién nacidos. La producción de leche suele ser menor cuanto más temprana es la edad gestacional⁵. En estos casos, la mejor opción para alimentar al recién nacido es la leche pasteurizada de donante proporcionada por los Bancos de Leche Humana (HMB)⁶.

Brasil tiene la mayor y más extensa red de HMBs del mundo⁷. Esta red recolecta, prepara y distribuye más de 160.000 L de leche humana pasteurizada de donante (MDP) en todo el país sin costo para los padres, a través del Sistema Único de Salud, administrado por el Ministerio de Salud⁷. La pasteurización es fundamental para garantizar la bioseguridad de la leche donada destinada a los recién nacidos. Este proceso se suele llevar a cabo mediante el método Holder, que consiste en sumergir un recipiente de leche materna cruda de donante en un baño de agua a 62,5 °C durante 30 min ^6,8. A continuación, el PDM resultante se almacena en refrigeración hasta que esté listo para el consumo. Sin embargo, la pasteurización reduce la viabilidad de la microbiota comensal de la leche y disminuye la biodisponibilidad de varios componentes bioactivos. Esto se debe a que el proceso de pasteurización está estandarizado para evitar la transmisión de microorganismos patógenos al recién nacido. En este contexto, Cacho y colaboradores describieron en 2017 la posibilidad de reconstituir la microbiota comensal de la propia leche materna inoculándola en diversas proporciones en PDM⁹. Sus hallazgos demostraron que el uso de una concentración del 10% de la propia leche materna (MOM) es la concentración óptima para mantener la composición original del perfil del microbioma MOM. Este enfoque reduce el riesgo de crecimiento excesivo de bacterias específicas, que, aunque suelen ser comensales, podrían volverse dañinas si están presentes de manera desproporcionada en la leche reconstituida. Específicamente, el estudio observó que una dilución 1:10 (10% de MOM + 90% de PDM), incubada durante 4 h, resultó en una carga bacteriana bien equilibrada, aproximadamente el 60% de la que se encuentra en el MOM sin diluir, lo que indica un enfoque más seguro y efectivo. Por el contrario, las diluciones más altas, como 3:10, provocaron un crecimiento bacteriano excesivo, lo que pone de manifiesto la necesidad crítica de concentraciones y condiciones controladas para garantizar la seguridad.

En este artículo, demostramos que este procedimiento de reconstitución de la microbiota de la leche materna en la MDP se puede lograr en situaciones reales dentro de la atención rutinaria de un hospital de maternidad y su banco de leche humana asociado.

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Protocolo

Este protocolo se realizó como parte de los procedimientos de un ensayo clínico realizado por nuestro grupo de investigación (Registro Brasileño de Ensayos Clínicos, ReBEC RBR-729kr8x), y recibió la aprobación del Comité de Ética (proceso CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes antes de la aleatorización y la recolección de muestras.

El procedimiento de reconstitución de la microbiota láctea se realiza en tres etapas:

1. Obtención de leche cruda materna

NOTA: El procedimiento para obtener leche se puede encontrar en otro lugar^10,11.

1. Antes del procedimiento, obtenga el consentimiento informado de la madre de acuerdo con el comité de ética y asegúrese de explicarle todo lo que se le hará a la madre, abordando cualquier duda, inquietud, miedo y ansiedad sobre el procedimiento para mantener a la madre relajada.
2. Hacer que la madre extraiga la leche mediante un extractor de leche eléctrico en un recipiente esterilizado bajo la supervisión de la enfermera responsable de la unidad, siguiendo las normas de higiene locales establecidas en cada sala de maternidad.
3. Después de la recolección, etiquete el recipiente que contiene la leche con la información de la madre, la fecha y la hora de la recolección. Mantenga la leche materna (MOM) a una temperatura de -4 °C o inferior durante un máximo de 12 h.

2. Descongelación de leche pasteurizada de donante (PDM)

NOTA: Los HMB tienen su propio stock de PDM, congelado a una temperatura inferior a -4 °C durante un período máximo de hasta 6 meses, y el procedimiento está bien descrito en la literatura de otros lugares 12,13,14.

1. Descongele la leche cruda o PDM almacenada en recipientes de vidrio esterilizados con tapas de plástico en un baño de agua a 40 °C, lo que garantiza el mantenimiento de la temperatura y un tiempo de procesamiento más corto.
   NOTA: No descongele el PDM a temperatura ambiente o a temperatura de refrigeración (dentro del refrigerador), ya que los tiempos de descongelación en estos casos se prolongan, lo que promueve la exposición y el crecimiento microbiano.
2. Retire los biberones de leche materna del baño de agua antes de que la leche del biberón alcance una temperatura superior a 5 °C.

3. Inoculación de PDM con MOM para la reconstitución del microbioma

NOTA: La relación volumétrica estándar para el proceso de inoculación de PDM con MOM es del 90%: 10% (v/v). Los pasos del procedimiento son los siguientes:

1. Indique al técnico que use una bata de laboratorio, mascarilla, gorra y guantes.
2. Limpie la superficie de trabajo con una solución de limpieza de superficies siguiendo el protocolo institucional local.
3. Organizar los materiales que se van a utilizar y preparar el equipo. Precalentar la incubadora (baño maría) con agua a 37 °C.
4. Planifique el volumen final de leche inoculada que se utilizará y seleccione un recipiente del tamaño adecuado. Coloque el recipiente con MOM crudo fresco y el PDM en forma líquida sobre la superficie de trabajo.
5. Recoger una alícuota de hasta 1 mL de la MOM utilizando un equipo estéril para la posterior secuenciación de 16S y recuento bacteriano. Almacene la alícuota en un tubo criogénico libre de DNasa/RNasa a -80 °C.
6. Transfiera el volumen restante, equivalente al 10% del volumen final deseado de leche, utilizando un instrumento volumétrico estéril (por ejemplo, jeringa, pipeta) a un recipiente apto para alimentos que se sumergirá en un baño de agua a 37 °C.
7. Recoger una alícuota de 1 mL de la PDM utilizando un equipo estéril para la posterior secuenciación de 16S y recuento bacteriano. Almacene la alícuota en un tubo criogénico libre de DNasa/RNasa a -80 °C.
8. Transfiera una cantidad de PDM equivalente al 90% del volumen final deseado de leche utilizando un instrumento volumétrico estéril (por ejemplo, jeringa, pipeta) al recipiente con el MOM del paso anterior, formando ahora la leche materna (IM) inoculada.
9. Sellar el recipiente con una tapa que impida que cualquier líquido externo contamine el interior de la botella y sumergirlo en el baño maría a 37 °C durante 4 h para permitir que los microorganismos inoculados en la leche se multipliquen.
10. Pasadas las 4 h, retira el recipiente con la IM fermentada del baño de agua, ahora llamada leche reconstituida (RM).
11. Reserve una alícuota de hasta 1 mL utilizando un equipo estéril para la posterior secuenciación de 16S y recuento bacteriano. Almacene la alícuota en un criotubo libre de DNasa/RNasa a -80 °C.
12. Transfiera el volumen restante a un recipiente desinfectado para alimentar a los recién nacidos.

4. Validación del método mediante cultivo bacteriano en placas

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles para evitar la contaminación y garantizar la precisión de las diluciones. El crecimiento bacteriano puede estimarse utilizando los métodos descritos en otros lugares ^9,15.

1. Prepare diluciones seriadas de cada muestra de leche (PDM, MOM, IM, RM) en solución salina estéril a concentraciones ^{de 10-1}, ^10-2, ^10-3 y ^10-4 . Mezcle bien cada dilución para garantizar una distribución bacteriana uniforme.
2. Pipetear y esparcir 100 μL de cada muestra diluida en placas de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) y agar sal de manitol (MSA) por triplicado, utilizando un asa Drigalski estéril o un esparcidor de vidrio. Asegúrese de que el volumen se distribuya uniformemente en la placa de agar.
3. Incubar placas de agar MRS en un frasco anaeróbico para crear un ambiente de bajo oxígeno para el crecimiento de bacterias de ácido láctico.
4. Incubar placas de agar sal de manitol (MSA) aeróbicamente para apoyar el crecimiento de las especies de Staphylococcus.
5. Incubar las placas a 37 ± 2 °C durante 48-72 h.
6. Seleccione la dilución con un número contable de colonias bacterianas (25-250 colonias) en cada tipo de agar
7. Cuente las colonias visibles en cada una de las tres placas replicadas para la dilución seleccionada.
8. Calcule el recuento promedio de colonias a partir de placas triplicadas para la dilución seleccionada en medios MRS y MSA.
9. Determine el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml para cada muestra utilizando la siguiente fórmula y conviértala a una escala logarítmica de base 10 (log10) para facilitar la interpretación. Proceda con el análisis estadístico de los resultados.
   Número de UFC/mL = Número de colonias × factor de dilución total/volumen sembrado en mL

5. Análisis del microbioma lácteo

NOTA: El análisis del microbioma de la leche se puede realizar de acuerdo con los métodos y la tubería descritos en otra parte¹⁶. En la figura complementaria S1 se presenta una captura de pantalla del script de R utilizado en este análisis.

1. Centrifugar 500 μL de la muestra durante 15 s a 180 × g para sedimentar células y partículas.
2. Recoja 350 μL del sobrenadante y utilícelo para la extracción de ADN.
3. Cuantificar el ADN extraído utilizando un espectrofotómetro.
4. Amplifique las regiones V3 y V4 del ARN ribosómico 16S utilizando 20 ng de ADN y cebadores 357F/805R (ver Tabla de Materiales)¹⁷.
5. Utilice perlas magnéticas para purificar los amplicones resultantes y cuantifique los amplicones con códigos de barras utilizando un fluorímetro de ADN.
6. Secuencia los amplicones en el modo de 250 bp de extremo emparejado.
7. Procese las secuencias resultantes realizando un recorte de calidad y la extracción del adaptador¹⁸. Utilice el modo de extremo emparejado (PE) con puntuación Phred33 y establezca una longitud de lectura mínima de 200 pb para garantizar lecturas de alta calidad.
8. Importe datos de secuencia de extremos emparejados en QIIME 2¹⁹ utilizando un formato de archivo de manifiesto y el comando: qiime tools import.
9. Procese las secuencias importadas con DADA2 para la eliminación de ruido, la replicación y la eliminación de quimeras mediante el comando: qiime dada2 denoise-paired. Este paso genera secuencias representativas de alta calidad y una tabla de características.
10. Filtre las características y secuencias para conservar solo aquellas con suficiente representación utilizando los comandos: qiime feature-table filter-features y qiime feature-table filter-seqs.
11. Prepare una base de datos de referencia extrayendo regiones amplificadas por los cebadores (V3-V4) usando: qiime feature-classifier extract-reads.
12. Utilice el algoritmo VSEARCH para la clasificación taxonómica con la base de datos de referencia Silva en un umbral de identidad del 97% ejecutando el comando:
    qiime feature-classifier-consensus-vsearch
13. Integre las asignaciones taxonómicas con la tabla de características utilizando las herramientas de BIOM: biom add-metadata.
14. Realizar análisis estadísticos como se describe en otra parte^20,21.

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Resultados

Análisis de crecimiento bacteriano por cultivo en placa
Las pruebas microbiológicas realizadas para validar el método de inoculación de PDM con el MOM, propuesto por Cacho et ^al.9, demostraron que, con base en el recuento de UFC/mL, no hubo diferencias significativas entre las muestras de leche inoculadas antes y después de la incubación de 4 h. Sin embargo, se observaron diferencias en el número de colonias en estos dos puntos temporale...

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Discusión

En este trabajo presentamos un protocolo a aplicar en las maternidades asociadas a un banco de leche humana, con el objetivo de proporcionar a la MDP la reconstitución de la microbiota láctea de una madre concreta que, por diversas razones, no puede proporcionar suficiente leche a su recién nacido. El protocolo es simple y se basa esencialmente en dos pasos. La primera implica la aplicación de procedimientos rutinarios en los bancos de leche humana para la correcta recolección y pos...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC