母乳微生物群的个体化重构:现实世界中的可行方法

摘要

本文描述了在实际环境中使用母亲自身的乳汁微生物群重建巴氏杀菌捐赠乳微生物群的方案。它展示了有效的细菌生长和微生物组调节，支持该程序在妇产医院及其相关母乳库的常规护理中的可行应用。

摘要

母乳 （MOM） 是新生儿最完整的营养资源。在母亲无法产生足够的乳汁或无法母乳喂养的情况下，首选的替代方案是巴氏杀菌捐赠母乳 （PDM），通常由母乳库提供。与任何市售配方奶粉相比，PDM 提供了一系列卓越的营养和免疫元素。然而，为了确保生物安全，PDM 经过巴氏杀菌，这一过程使共生微生物群失活并减少某些生物活性化合物。本研究提出了一种方案，旨在使用 MOM 作为微生物来源来恢复 PDM 的微生物群，使该方法适应现实世界的临床环境。

该方案是在一家妇产医院及其相关的母乳库进行的临床试验中实施的，目的是为母亲无法产生足够乳汁的早产儿提供个性化的捐赠母乳。该方法包括用 10% 的 MOM 接种 PDM，然后在 37 °C 下孵育 4 小时。微生物学分析表明，孵化后接种乳 （IM） 中的细菌成功生长，重组乳 （RM） 的微生物群特征与 MOM 非常相似，表明微生物群恢复有效。这些结果表明，重建方案在新生儿护理中是可行的，有可能提高 PDM 的营养和免疫质量，从而支持非母乳喂养新生儿的健康和发育。

引言

母乳被广泛认为是新生儿的最佳营养来源，不仅提供必需的宏量和微量营养素，还提供一系列复杂的元素，包括各种代谢物和免疫系统的成分，如抗体、细胞因子和细胞¹。此外，母乳中的有益特性也来自共生微生物群落。母乳的所有这些元素在新生儿的发育中起着至关重要的作用¹。微生物群落（称为微生物群）受饮食、产妇生活方式、分娩类型和胎龄等因素的综合影响，导致每只牛奶都具有具有特定特征的微生物群²。母乳微生物群有益于新生儿发育的机制包括通过共生菌定植保护肠道表面，以及通过产生与肠道免疫细胞相互作用的代谢物来促进免疫系统成熟³。因此，每个母乳中微生物的个体化特征使其成为新生儿的一种个性化药物⁴。

健康微生物群的存在可以通过占据生态位和支持营养来帮助保护新生儿免受潜在病原微生物的定植，尤其是对于早产儿，由于在医院环境中并且免疫系统不成熟，他们更容易受到这些外部影响。此外，早产的母亲通常难以为新生儿分泌足够数量的乳汁。胎龄⁵ 岁时，产奶量通常越小越低。在这些情况下，喂养新生儿的最佳选择是母乳库 （HMB） 提供的巴氏杀菌捐赠母乳⁶。

巴西拥有世界上最大、最广泛的 HMB 网络⁷.该网络通过由卫生部管理的国家统一卫生系统 （Sistema Único de Saúde） 在全国范围内免费收集、制备和分发超过 160,000 升巴氏杀菌捐赠母乳 （PDM）⁷。巴氏杀菌对于确保捐献给新生儿的母乳的生物安全至关重要。该过程通常使用 Holder 方法进行，该方法包括将装有生捐赠母乳的容器浸入 62.5 °C 的水浴中 30 分钟 ^6,8。然后将生成的 PDM 冷藏起来，直到准备好食用。然而，巴氏杀菌会降低牛奶共生微生物群的活力，并降低各种生物活性成分的生物利用度。这是因为巴氏杀菌过程是标准化的，以防止病原微生物传播给新生儿。在此背景下，2017 年，Cacho 及其同事描述了通过将不同比例的母乳接种到 PDM⁹ 中来重建母乳共生微生物群的可能性。他们的研究结果表明，使用 10% 浓度的母乳 （MOM） 是维持 MOM 微生物组谱原始组成的最佳浓度。这种方法降低了特定细菌过度生长的风险，虽然这些细菌通常是共生的，但如果不成比例地存在于再造牛奶中，可能会变得有害。具体来说，该研究观察到，1:10 稀释液（10% MOM + 90% PDM）孵育 4 小时，导致细菌负荷均衡——大约是未稀释 MOM 的 60%——表明一种更安全、更有效的方法。相比之下，较高的稀释度（例如 3:10）会导致细菌过度生长，这凸显了对控制浓度和条件以确保安全性的迫切需求。

在本文中，我们证明了这种在 PDM 中重建母乳微生物群的过程可以在妇产医院及其相关母乳库的常规护理中在现实情况下实现。

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研究方案

该协议是作为我们的研究小组（巴西临床试验注册处，ReBEC RBR-729kr8x）进行的临床试验程序的一部分执行的，并获得了伦理委员会的批准（流程 CAAE nº 41063520.4.0 000.0121）并在随机化和样本收集之前获得了所有参与者的知情同意。

重构牛奶微生物群的过程分三个步骤完成:

1. 获取妈妈的生奶

注意:获取牛奶的程序可以在其他地方找到^10,11。

1. 在手术前，根据伦理委员会获得母亲的知情同意，并确保向母亲解释将要做的一切，解决对手术的任何疑问、担忧、恐惧和焦虑，以保持母亲放松。
2. 让母亲在负责该病房的护士的监督下，按照每个产科病房既定的当地卫生标准，使用电动吸奶器将乳汁挤入消毒容器中。
3. 收集后，在盛放母乳的容器上贴上母亲的信息、收集日期和时间的标签。将母乳 （MOM） 在 -4 °C 或更低的温度下保存长达 12 小时。

2. 巴氏杀菌捐赠乳汁 （PDM） 的解冻

注意:HMB 有自己的 PDM 库存，在低于 -4 °C 的温度下冷冻最长可达 6 个月，该过程在其他地方的文献中有详细描述12,13,14。

1. 将储存在带塑料盖的无菌玻璃容器中的生牛奶或 PDM 在 40 °C 的水浴中解冻，以确保温度维持和更短的加工时间。
   注意:请勿在室温或冷藏温度（冰箱内）解冻 PDM，因为在这些情况下解冻时间会延长，从而促进微生物暴露和生长。
2. 在奶瓶中的奶温达到 5 °C 以上之前，将母乳瓶从水浴中取出。

3. 用 MOM 接种 PDM 以进行微生物组重建

注:用 MOM 接种 PDM 的过程的标准体积比为 90%:10% （v/v）。该过程的步骤如下:

1. 指导技术人员穿上实验室外套、口罩、帽子和手套。
2. 按照当地机构规程，使用表面清洁液清洁工作台面。
3. 安排要使用的材料并准备设备。用水将培养箱（水浴）预热至 37 °C。
4. 计划要使用的接种牛奶的最终体积，并选择适当大小的容器。将装有新鲜生 MOM 和液体 PDM 的容器放在工作台面上。
5. 使用无菌设备收集最多 1 mL 的 MOM 等分试样，用于随后的 16S 测序和细菌计数。将等分试样储存在-80°C的无DNase / RNase的冻存管中。
6. 使用无菌容量法仪器（例如注射器、移液管）将剩余体积（相当于最终所需牛奶体积的 10%）转移到食品安全容器中，浸入 37 °C 的水浴中。
7. 使用无菌设备收集 1 mL 等分试样的 PDM，用于随后的 16S 测序和细菌计数。将等分试样储存在-80°C的无DNase / RNase的冻存管中。
8. 使用无菌容量法仪器（例如注射器、移液管）将相当于最终所需牛奶体积 90% 的 PDM 量转移到装有上一步 MOM 的容器中，现在形成接种的母乳 （IM）。
9. 用盖子密封容器，以防止任何外部液体污染瓶子内部，并将其浸入 37 °C 的水浴中 4 小时，以使接种在牛奶中的微生物繁殖。
10. 4 小时后，从水浴中取出装有发酵 IM 的容器，现在称为重组奶 （RM）。
11. 使用无菌设备保留最多 1 mL 的等分试样，用于后续的 16S 测序和细菌计数。将等分试样储存在 -80 °C 的无 DNase/RNase 冻存管中。
12. 将剩余的体积转移到消毒的容器中，以便喂养新生儿。

4. 通过在平板上培养细菌来验证方法

注:所有程序必须在无菌条件下进行，以防止污染并确保稀释的准确性。可以使用其他地方描述的方法估计细菌生长 ^9,15。

1. 在无菌盐水中制备每个牛奶样品（PDM、MOM、IM、RM）的 ^10-1、^10-2、^10-3 和 ^10-4 浓度的连续稀释液。充分混合每种稀释液，以确保细菌分布均匀。
2. 使用无菌 Drigalski 定量环或玻璃涂抹器，将 100 μL 每个稀释样品一式三份涂抹在 Man-Rogosa-Sharpe （MRS） 和甘露醇盐琼脂 （MSA） 板上。确保体积均匀分布在琼脂平板上。
3. 将 MRS 琼脂平板放入厌氧罐中孵育，为乳酸菌生长创造低氧环境。
4. 用好氧孵育甘露醇盐琼脂 （MSA） 板以支持葡萄球菌物种的生长。
5. 将板在 37 ± 2 °C 下孵育 48-72 小时。
6. 在每种类型的琼脂上选择具有可计数数量的细菌菌落（25-250 个菌落）的稀释液
7. 对所选稀释度的三个重复板中的每一个板上的可见菌落进行计数。
8. 计算在 MRS 和 MSA 培养基中所选稀释度的一式三份板的平均菌落计数。
9. 使用以下公式确定每个样品每 mL 的菌落形成单位 （CFU） 数量，并转换为以 10 为底的对数刻度 （log10） 以方便解释。继续对结果进行统计分析。
   CFU 数量/mL = 总稀释因子/体积×菌落数（以 mL 为单位）

5. 牛奶微生物组分析

注:牛奶微生物组分析可以根据其他地方描述的方法和管道进行¹⁶. 补充图 S1 中提供了本分析中使用的 R 脚本的屏幕截图。

1. 将 500 μL 样品以 180 × g 离心 15 秒，以沉淀细胞和颗粒。
2. 收集 350 μL 上清液并将其用于 DNA 提取。
3. 使用分光光度计定量提取的 DNA。
4. 使用 20 ng DNA 和引物 357F/805R 扩增 16S 核糖体 RNA 的 V3 和 V4 区域（参见 材料表）¹⁷。
5. 使用磁珠纯化所得扩增子，并使用 DNA 荧光计定量条形码扩增子。
6. 以双端 250 bp 模式对扩增子进行测序。
7. 通过执行质量修剪和适配器移除¹⁸ 来处理结果序列。使用带有 Phred33 评分的双端模式 （PE），并将最小读长设置为 200 bp，以确保高质量的读长。
8. 使用清单文件格式和命令 qiime tools import 将双端序列数据导入 QIIME 2¹⁹ 。
9. 使用 DADA2 处理导入的序列，以去除噪、去重和去除嵌合体，方法是使用命令 qiime dada2 denoise-paired。此步骤生成高质量的代表性序列和特征表。
10. 使用以下命令过滤特征和序列，以仅保留具有足够表示的特征和序列:qiime feature-table filter-features 和 qiime feature-table filter-seqs。
11. 通过使用 qiime 特征分类器 extract-reads 提取引物 （V3-V4） 扩增的区域来准备参考数据库。
12. 通过执行以下命令，将 VSEARCH 算法与 Silva 参考数据库一起以 97% 的同一阈值进行分类:
    qiime 特征分类器 classify-consensus-vsearch
13. 使用 BIOM 工具将分类分配与特征表集成: biom add-metadata。
14. 按照其他处所述进行统计分析 ^20,21。

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结果

通过平板培养进行细菌生长分析
Cacho 等人 ⁹ 提出的为验证用 MOM 接种 PDM 的方法而进行的微生物测试表明，根据 CFU/mL 计数，接种的牛奶样品在 4 小时孵育前后没有显着差异。然而，在这两个时间点观察到菌落数量的差异，表明在 葡萄球菌 属的 MSA（图 1A）和乳酸菌 （LAB） 的 MRS 培养基（图 1B

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讨论

在这里，我们提出了一种适用于与母乳库相关的妇产医院的方案，旨在为 PDM 提供来自特定母亲的乳汁微生物群的重建，该母亲由于各种原因无法为新生儿提供足够的乳汁。该协议很简单，基本上基于两个步骤。第一个涉及应用在母乳库中常规执行的程序，以正确收集和随后对捐赠母乳进行巴氏杀菌，以及收集母乳，其微生物群将得到扩展 ^6,7,8

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC