בנייה מחדש אישית של מיקרוביוטה של חלב אם: גישה ישימה בסביבות בעולם האמיתי

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול לבנייה מחדש של מיקרוביוטת חלב תורם מפוסטר באמצעות מיקרוביוטת חלב האם עצמה בסביבות מעשיות בעולם האמיתי. הוא מדגים גדילה יעילה של חיידקים ומודולציית מיקרוביום, ותומך ביישום אפשרי של הליך זה במסגרת הטיפול השגרתי בבית חולים ליולדות ובבנק חלב האם הקשור אליו.

Abstract

חלב אם (MOM) הוא המשאב התזונתי השלם ביותר לתינוקות. במקרים בהם אימהות אינן מסוגלות לייצר מספיק חלב או אינן יכולות להניק, החלופה המועדפת היא חלב אם תורם מפוסטר (PDM), המסופק באופן שגרתי על ידי בנקי חלב אם. PDM מציע מגוון מעולה של רכיבים תזונתיים ואימונולוגיים בהשוואה לכל נוסחה מסחרית זמינה. עם זאת, כדי להבטיח בטיחות ביולוגית, PDM עובר פסטור, תהליך שמשבית את המיקרוביוטה הקומנסלית ומפחית תרכובות ביו-אקטיביות מסוימות. מחקר זה מציג פרוטוקול שנועד לשחזר את המיקרוביוטה של PDM באמצעות MOM כמקור מיקרוביאלי, תוך התאמת הגישה לסביבה קלינית בעולם האמיתי.

הפרוטוקול יושם בניסוי קליני שנערך בבית חולים ליולדות ובבנק חלב האם הקשור אליו, במטרה לספק חלב תורם מותאם אישית לפגים שאמהותיהם אינן יכולות לייצר מספיק חלב. המתודולוגיה כוללת חיסון PDM עם 10% של MOM, ואחריו דגירה ב 37 ° C במשך 4 שעות. ניתוח מיקרוביולוגי הראה גידול חיידקים מוצלח בחלב המחוסן (IM) לאחר הדגירה, כאשר פרופיל המיקרוביוטה של החלב המשוחזר (RM) דומה מאוד לזה של MOM, מה שמצביע על שיקום מיקרוביוטה יעיל. תוצאות אלה מצביעות על כך שפרוטוקול ההרכבה מחדש אפשרי ליישום בטיפול בילוד, עם פוטנציאל לשפר את האיכות התזונתית והחיסונית של PDM, ובכך לתמוך בבריאות ובהתפתחות של יילודים שאינם יונקים.

Introduction

חלב אם מוכר באופן נרחב כמקור התזונה הטוב ביותר לתינוקות, ומספק לא רק מאקרו ומיקרונוטריאנטים חיוניים, אלא גם מערך מורכב של אלמנטים, כולל מטבוליטים ורכיבים שונים של מערכת החיסון, כגון נוגדנים, ציטוקינים ותאים¹. בנוסף, התכונות המועילות בחלב אם נובעות גם מקהילה של מיקרואורגניזמים קומנסליים. כל האלמנטים האלה של חלב אם לשחק תפקיד מכריע בהתפתחות של התינוק¹. קהילת המיקרואורגניזמים, המכונה מיקרוביוטה, מושפעת משילוב של גורמים כגון תזונה, אורח חיים אימהי, סוג הלידה וגיל ההריון, וכתוצאה מכך לכל חלב יש מיקרוביוטה עם מאפיינים מסוימים². המנגנונים שבאמצעותם מיקרוביוטת חלב האם מועילה להתפתחות היילודים נעים בין הגנה על פני השטח האנטרי דרך קולוניזציה על ידי חיידקים קומנסליים ועד לקידום הבשלת מערכת החיסון באמצעות ייצור מטבוליטים המקיימים אינטראקציה עם תאי החיסון במעי³. מסיבה זו, הפרופיל האישי של מיקרואורגניזמים בחלב האם הופך אותו לסוג של רפואה מותאמת אישית לתינוקות⁴.

נוכחותה של מיקרוביוטה בריאה יכולה לסייע בהגנה על היילוד מפני קולוניזציה על ידי מיקרואורגניזמים פתוגניים פוטנציאליים על ידי כיבוש הנישה האקולוגית ותמיכה בתזונה, במיוחד עבור פגים, הפגיעים יותר להשפעות חיצוניות אלה בשל הימצאותם בסביבת בית חולים ומערכת חיסונית לא בוגרת. יתר על כן, אמהות שיולדות בטרם עת מתקשות לעתים קרובות לייצר חלב בכמויות מספיקות לתינוקות שלהן. ייצור החלב בדרך כלל נמוך יותר ככל שגיל^ההריון צעיר יותר 5. במקרים אלה, האפשרות הטובה ביותר להאכיל את התינוק היא חלב תורם מפוסטר המסופק על ידי בנק חלב אם (HMB)⁶.

ברזיל יש את הרשת הגדולה והנרחבת ביותר של HMBs בעולם⁷. רשת זו אוספת, מכינה ומפיצה יותר מ-160,000 ליטר חלב אם מתורם מפוסטר (PDM) ברחבי הארץ ללא עלות להורים, באמצעות מערכת הבריאות הלאומית המאוחדת (Sistema Único de Saúde), המנוהלת על ידי משרד הבריאות⁷. פסטור חיוני כדי להבטיח את הבטיחות הביולוגית של החלב שנתרם המיועד לתינוקות. תהליך זה מתבצע בדרך כלל בשיטת הולדר, הכוללת טבילת מיכל של חלב אם תורם גולמי באמבט מים ב 62.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ^6,8. ה-PDM המתקבל מאוחסן לאחר מכן בקירור עד שהוא מוכן לצריכה. עם זאת, הפסטור מפחית את הכדאיות של המיקרוביוטה הקומנסלית של החלב ומקטין את הזמינות הביולוגית של רכיבים ביו-אקטיביים שונים. הסיבה לכך היא כי תהליך הפסטור הוא סטנדרטי כדי למנוע העברת מיקרואורגניזמים פתוגניים לתינוק. בהקשר זה, בשנת 2017, קאצ'ו ועמיתיו תיארו את האפשרות לשחזר את המיקרוביוטה הקומנסלית של חלב האם עצמו על ידי חיסונו בפרופורציות שונות לתוך PDM⁹. ממצאיהם הראו כי שימוש בריכוז של 10% של חלב האם עצמו (MOM) הוא הריכוז האופטימלי לשמירה על ההרכב המקורי של פרופיל המיקרוביום של MOM. גישה זו מפחיתה את הסיכון לצמיחת יתר של חיידקים ספציפיים, אשר, למרות שבדרך כלל הם קומנסליים, עלולים להזיק אם הם נמצאים באופן לא פרופורציונלי בחלב המשוחזר. באופן ספציפי, המחקר הבחין כי דילול של 1:10 (10% MOM + 90% PDM), שהודגר במשך 4 שעות, הביא לעומס חיידקי מאוזן היטב - כ -60% מזה שנמצא ב- MOM לא מדולל - מה שמצביע על גישה בטוחה ויעילה יותר. לעומת זאת, דילולים גבוהים יותר, כגון 3:10, הובילו לצמיחת יתר של חיידקים, מה שהדגיש את הצורך הקריטי בריכוזים ותנאים מבוקרים כדי להבטיח בטיחות.

במאמר זה, אנו מראים כי הליך זה של בנייה מחדש של מיקרוביוטת חלב אם ב- PDM יכול להיות מושג במצבים בעולם האמיתי במסגרת הטיפול השגרתי של בית חולים ליולדות ובנק החלב האנושי הקשור אליו.

Protocol

פרוטוקול זה בוצע כחלק מההליכים של ניסוי קליני שנערך על ידי קבוצת המחקר שלנו (הרישום הברזילאי לניסויים קליניים, ReBEC RBR-729kr8x), וקיבל את אישור ועדת האתיקה (תהליך CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) והסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים לפני אקראיות ואיסוף דגימות.

הליך השחזור של מיקרוביוטת החלב נעשה בשלושה שלבים:

1. קבלת חלב אם גולמי

הערה: הליך קבלת חלב ניתן למצוא במקום אחר^10,11.

1. לפני ההליך, יש לקבל הסכמה מדעת של היולדת על פי ועדת האתיקה ולהקפיד להסביר ליולדת את כל מה שייעשה, תוך התייחסות לכל ספק, חשש, חשש וחרדות לגבי ההליך כדי לשמור על היולדת רגועה.
2. בקשו מהאם לשאוב חלב באמצעות משאבת חלב חשמלית למיכל מעוקר בפיקוח האחות האחראית על היחידה, בהתאם לתקני ההיגיינה המקומיים שנקבעו בכל מחלקת יולדות.
3. לאחר האיסוף, יש לתייג את המיכל המכיל את החלב עם פרטי האם, תאריך ושעת האיסוף. שמור את חלב האם (MOM) בטמפרטורה של -4 ° C או נמוך יותר עד 12 שעות.

2. הפשרת חלב תורם מפוסטר (PDM)

הערה: ל- HMBs יש מלאי PDM משלהם, מוקפא בטמפרטורה מתחת ל -4 ° C לתקופה מקסימלית של עד 6 חודשים, וההליך מתואר היטב בספרות במקום אחר 12,13,14.

1. הפשירו חלב גולמי או PDM המאוחסנים במיכלי זכוכית מעוקרים עם מכסי פלסטיק באמבט מים בטמפרטורה של 40°C, מה שמבטיח שמירה על הטמפרטורה וזמן עיבוד קצר יותר.
   הערה: אין להפשיר PDM בטמפרטורת החדר או בטמפרטורת קירור (בתוך המקרר), מכיוון שזמני ההפשרה במקרים אלה מתארכים, מה שמעודד חשיפה וגדילה של חיידקים.
2. הסר בקבוקי חלב אם מאמבט המים לפני שהחלב בבקבוק מגיע לטמפרטורה מעל 5 מעלות צלזיוס.

3. חיסון PDM עם MOM להרכבה מחדש של המיקרוביום

הערה: היחס הנפחי הסטנדרטי לתהליך חיסון PDM עם MOM הוא 90%: 10% (v/v). שלבי ההליך הם כדלקמן:

1. יש להנחות את הטכנאי ללבוש מעיל מעבדה, מסכה, כובע וכפפות.
2. נקו את משטח העבודה באמצעות פתרון ניקוי משטחים בהתאם לפרוטוקול מוסדי מקומי.
3. סדרו את החומרים שישמשו והכינו את הציוד. מחממים את האינקובטור (אמבט מים) במים ל -37 מעלות צלזיוס.
4. תכננו את הנפח הסופי של חלב מחוסן לשימוש ובחרו מיכל בגודל מתאים. הניחו את המיכל עם MOM גולמי טרי ואת PDM בצורה נוזלית על משטח העבודה.
5. לאסוף aliquot של עד 1 מ"ל של MOM באמצעות ציוד סטרילי עבור ריצוף 16S הבאים ספירת חיידקים. אחסן את aliquot ב cryotube ללא DNase / RNase ב -80 ° C.
6. העבירו את הנפח הנותר, שווה ערך ל-10% מהנפח הסופי הרצוי של חלב, באמצעות מכשיר נפחי סטרילי (למשל מזרק, פיפטה) למיכל בטוח למזון לטבילה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
7. לאסוף aliquot 1 מ"ל של PDM באמצעות ציוד סטרילי עבור ריצוף 16S הבאים ספירת חיידקים. אחסן את aliquot ב cryotube ללא DNase / RNase ב -80 ° C.
8. העבירו כמות של PDM השווה ל-90% מהנפח הסופי הרצוי של חלב באמצעות מכשיר נפחי סטרילי (למשל, מזרק, פיפטה) למיכל עם MOM מהשלב הקודם, וכעת יוצרים את חלב האם המחוסן (IM).
9. אטמו את המיכל עם מכסה המונע מכל נוזל חיצוני לזהם את החלק הפנימי של הבקבוק וטבלו אותו באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות כדי לאפשר למיקרואורגניזמים המחוסנים בחלב להתרבות.
10. לאחר 4 שעות, הסר את המיכל עם IM מותסס מאמבט המים, שנקרא כעת חלב משוחזר (RM).
11. שמור aliquot של עד 1 מ"ל באמצעות ציוד סטרילי עבור ריצוף 16S הבאים וספירה חיידקית. אחסן את מאגר aliquot בצינור קריו-צינור ללא DNase/RNase בטמפרטורה של -80°C.
12. מעבירים את הנפח הנותר למיכל מחוטא להאכלת תינוקות.

4. תיקוף השיטה על ידי גידול חיידקים על צלחות

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום ולהבטיח את דיוק הדילולים. ניתן להעריך את גדילת החיידקים באמצעות שיטות המתוארות במקום אחר ^9,15.

1. הכינו דילולים סדרתיים של כל דגימת חלב (PDM, MOM, IM, RM) במי מלח סטריליים בריכוזים ^10-1, ^10-2, ^{10-3 ו-10-4} . ערבבו היטב כל דילול כדי להבטיח פיזור חיידקים אחיד.
2. פיפט ומרח 100 μL מכל דגימה מדוללת על לוחות Man-Rogosa-Sharpe (MRS) ו- Mannitol Salt Agar (MSA) בטריפליקטים, באמצעות לולאת דריגלסקי סטרילית או מפזר זכוכית. מוודאים שהנפח מפוזר באופן אחיד על צלחת האגר.
3. יש לדגור על צלחות אגר MRS בצנצנת אנאירובית המכילה כדי ליצור סביבה דלת חמצן לצמיחת חיידקי חומצה לקטית.
4. לדגור על צלחות אגר מלח מניטול (MSA) באופן אירובי כדי לתמוך בגדילה של מיני סטפילוקוקוס.
5. לדגור את הצלחות ב 37 ± 2 ° C במשך 48-72 שעות.
6. בחר את הדילול עם מספר ניתן לספור של מושבות חיידקים (25-250 מושבות) על כל סוג של אגר
7. ספרו מושבות גלויות בכל אחד משלושת הלוחות המשוכפלים לדילול שנבחר.
8. חשב את ספירת המושבה הממוצעת מלוחות משולשים עבור הדילול שנבחר הן במדיה MRS והן במדיה MSA.
9. קבע את מספר היחידות יוצרות המושבה (CFU) לכל מ"ל עבור כל דגימה באמצעות הנוסחה הבאה והמיר לסולם לוגריתמי בסיס 10 (log10) כדי להקל על הפרשנות. המשך בניתוח סטטיסטי של התוצאות.
   מספר CFU/מ"ל = מספר המושבות × גורם דילול כולל/נפח מצופה במ"ל

5. ניתוח מיקרוביום חלב

הערה: ניתוח מיקרוביום החלב יכול להתבצע על פי השיטות והצנרת המתוארות במקום אחר¹⁶. צילום מסך של סקריפט R המשמש בניתוח זה מוצג באיור משלים S1.

1. צנטריפוגה 500 μL של הדגימה עבור 15 s ב 180 × גרם לתאי משקעים וחלקיקים.
2. לאסוף 350 μL של supernatant ולהשתמש בו עבור מיצוי DNA.
3. כמת את הדנ"א המופק באמצעות ספקטרופוטומטר.
4. הגבירו את אזורי V3 ו-V4 של הרנ"א הריבוזומלי 16S באמצעות 20 ננוגרם של דנ"א ופריימרים 357F/805R (ראו טבלת חומרים)¹⁷.
5. השתמש בחרוזים מגנטיים כדי לטהר את האמפליקונים המתקבלים ולכמת אמפליקונים מקודדים באמצעות פלואורימטר DNA.
6. רצף את האמפליקונים במצב זוגי של 250 bp.
7. עבד את הרצפים המתקבלים על ידי ביצוע חיתוך איכותי והסרת מתאם¹⁸. השתמש במצב קצה משויך (PE) עם ניקוד Phred33 והגדר אורך קריאה מינימלי של 200 bp כדי להבטיח קריאה באיכות גבוהה.
8. ייבא נתוני רצף משויך ל- QIIME 2¹⁹ באמצעות תבנית קובץ מניפסט והפקודה: ייבוא כלי qiime.
9. עבד את הרצפים המיובאים עם DADA2 לצורך דנויזציה, שכפול והסרת כימרה באמצעות הפקודה: qiime dada2 denoise-paired. שלב זה יוצר רצפים מייצגים באיכות גבוהה וטבלת תכונות.
10. סנן תכונות ורצפים כדי לשמור רק על אלה עם ייצוג מספיק באמצעות הפקודות: qiime feature-table filter-features ו-qiime feature-table filter-seqs.
11. הכן מסד נתונים של הפניות על-ידי חילוץ אזורים המוגברים על-ידי הפריימרים (V3-V4) באמצעות: qiime feature-classifier extract-reads.
12. השתמש באלגוריתם VSEARCH לסיווג טקסונומי עם מסד הנתונים של סילבה בסף זהות של 97% על ידי ביצוע הפקודה:
    Qiime Feature-Classifier classify-consensus-vsearch
13. שלב הקצאות טקסונומיות עם טבלת התכונות באמצעות כלי BIOM: biom add-metadata.
14. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים כמתואר במקום אחר^20,21.

תוצאות

ניתוח צמיחת חיידקים על ידי גידול צלחות
הבדיקות המיקרוביולוגיות שנערכו כדי לאמת את שיטת חיסון PDM עם MOM, כפי שהוצע על ידי Cacho et ^al.9, הראו כי, בהתבסס על ספירת CFU/mL, לא היו הבדלים משמעותיים בין דגימות החלב שחוסנו לפני ואחרי הדגירה של 4 שעות. אולם הבדלים במספ...

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקול שייושם בבתי חולים ליולדות הקשורים לבנק חלב אם, במטרה לספק PDM את ההרכבה מחדש של מיקרוביוטת החלב מאם ספציפית אשר, מסיבות שונות, אינה יכולה לספק מספיק חלב ליילוד שלה. הפרוטוקול פשוט ומבוסס בעיקרו על שני שלבים. הראשון כרוך ביישום נהלים המבוצעים באופן ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC