Ricostituzione individualizzata del microbiota del latte umano: un approccio fattibile in contesti del mondo reale

Riepilogo

L'articolo descrive un protocollo per ricostituire il microbiota del latte donato pastorizzato utilizzando il microbiota del latte materno in contesti pratici e reali. Dimostra un'efficace crescita batterica e modulazione del microbioma, supportando l'applicazione fattibile di questa procedura all'interno delle cure di routine di un ospedale di maternità e della banca del latte umano associata.

Abstract

Il latte materno (MOM) è la risorsa nutrizionale più completa per i neonati. Nei casi in cui le madri non sono in grado di produrre latte a sufficienza o non possono allattare al seno, l'alternativa preferita è il latte umano pastorizzato di donazione (PDM), che viene regolarmente fornito dalle banche del latte umano. PDM offre una gamma superiore di elementi nutrizionali e immunologici rispetto a qualsiasi formula disponibile in commercio. Tuttavia, per garantire la biosicurezza, il PDM viene sottoposto a pastorizzazione, un processo che inattiva il microbiota commensale e riduce alcuni composti bioattivi. Questo studio presenta un protocollo progettato per ripristinare il microbiota della PDM utilizzando MOM come fonte microbica, adattando l'approccio a un contesto clinico del mondo reale.

Il protocollo è stato implementato in uno studio clinico condotto presso un ospedale di maternità e la banca del latte umano associata, con l'obiettivo di fornire latte donato personalizzato ai neonati prematuri le cui madri non possono produrre latte a sufficienza. La metodologia prevede l'inoculazione di PDM con il 10% di MOM, seguita da incubazione a 37 °C per 4 ore. L'analisi microbiologica ha dimostrato una crescita batterica di successo nel latte inoculato (IM) dopo l'incubazione, con il profilo del microbiota del latte ricostituito (RM) molto simile a quello del MOM, indicando un efficace ripristino del microbiota. Questi risultati suggeriscono che il protocollo di ricostituzione è fattibile per l'implementazione nell'assistenza neonatale, con il potenziale di migliorare la qualità nutrizionale e immunologica del PDM, supportando così la salute e lo sviluppo dei neonati non allattati al seno.

Introduzione

Il latte materno è ampiamente riconosciuto come la migliore fonte di nutrimento per i neonati, fornendo non solo macro e micronutrienti essenziali, ma anche una complessa gamma di elementi, tra cui vari metaboliti e componenti del sistema immunitario, come anticorpi, citochine e cellule¹. Inoltre, le proprietà benefiche del latte materno derivano anche da una comunità di microrganismi commensali. Tutti questi elementi del latte materno svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del neonato¹. La comunità di microrganismi, nota come microbiota, è influenzata da una combinazione di fattori come la dieta, lo stile di vita materno, il tipo di parto e l'età gestazionale, con il risultato che ogni latte ha un microbiota con caratteristiche particolari². I meccanismi attraverso i quali il microbiota del latte materno favorisce lo sviluppo neonatale vanno dalla protezione della superficie enterica attraverso la colonizzazione da parte di batteri commensali alla promozione della maturazione del sistema immunitario attraverso la produzione di metaboliti che interagiscono con le cellule immunitarie nell'intestino³. Per questo motivo, il profilo individualizzato dei microrganismi nel latte materno lo rende una forma di medicina personalizzata per i neonati⁴.

La presenza di un microbiota sano può aiutare a proteggere il neonato dalla colonizzazione da parte di microrganismi potenzialmente patogeni occupando la nicchia ecologica e supportando la nutrizione, soprattutto per i neonati prematuri, che sono più vulnerabili a questi impatti esterni a causa del fatto di trovarsi in un ambiente ospedaliero e di avere un sistema immunitario immaturo. Inoltre, le madri che partoriscono prematuramente hanno spesso difficoltà a produrre latte in quantità sufficienti per i loro neonati. La produzione di latte è in genere inferiore quanto più giovane è l'età gestazionale^{di 5 anni}. In questi casi, l'opzione migliore per l'alimentazione del neonato è il latte di donatrice pastorizzato fornito dalle banche del latte umano (HMB)⁶.

Il Brasile ha la più grande ed estesa rete di HMB al mondo⁷. Questa rete raccoglie, prepara e distribuisce più di 160.000 litri di latte umano pastorizzato da donatore (PDM) in tutto il paese senza alcun costo per i genitori, attraverso il sistema sanitario unificato nazionale (Sistema Único de Saúde), gestito dal Ministero della Salute⁷. La pastorizzazione è fondamentale per garantire la biosicurezza del latte donato destinato ai neonati. Questo processo viene solitamente eseguito con il metodo Holder, che prevede l'immersione di un contenitore di latte materno crudo di donatrice in un bagno d'acqua a 62,5 °C per 30 minuti ^6,8. Il PDM risultante viene quindi conservato in refrigerazione fino a quando non è pronto per il consumo. Tuttavia, la pastorizzazione riduce la vitalità del microbiota commensale del latte e diminuisce la biodisponibilità di vari componenti bioattivi. Questo perché il processo di pastorizzazione è standardizzato per prevenire la trasmissione di microrganismi patogeni al neonato. In questo contesto, nel 2017, Cacho e colleghi hanno descritto la possibilità di ricostituire il microbiota commensale del latte materno inoculandolo in varie proporzioni nel PDM⁹. I loro risultati hanno dimostrato che l'utilizzo di una concentrazione del 10% del latte materno (MOM) è la concentrazione ottimale per mantenere la composizione originale del profilo del microbioma MOM. Questo approccio riduce il rischio di crescita eccessiva di batteri specifici, che, sebbene tipicamente commensali, potrebbero diventare dannosi se presenti in modo sproporzionato nel latte ricostituito. In particolare, lo studio ha osservato che una diluizione 1:10 (10% MOM + 90% PDM), incubata per 4 ore, ha portato a una carica batterica ben bilanciata - circa il 60% di quella trovata nel MOM non diluito - indicando un approccio più sicuro ed efficace. Al contrario, diluizioni più elevate, come 3:10, hanno portato a un'eccessiva crescita batterica, evidenziando la necessità critica di concentrazioni e condizioni controllate per garantire la sicurezza.

In questo articolo, dimostriamo che questa procedura di ricostituzione del microbiota del latte materno nella PDM può essere ottenuta in situazioni del mondo reale all'interno delle cure di routine di un ospedale di maternità e della sua banca del latte umano associata.

Protocollo

Questo protocollo è stato eseguito nell'ambito delle procedure di uno studio clinico condotto dal nostro gruppo di ricerca (Registro brasiliano degli studi clinici, ReBEC RBR-729kr8x), e ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico (processo CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della randomizzazione e della raccolta dei campioni.

La procedura di ricostituzione del microbiota del latte si svolge in tre fasi:

1. Ottenere il latte crudo della madre

NOTA: La procedura per ottenere il latte può essere trovata altrove ^10,11.

1. Prima della procedura, ottieni il consenso informato dalla madre secondo il comitato etico e assicurati di spiegare tutto ciò che verrà fatto alla madre, affrontando eventuali dubbi, preoccupazioni, paure e ansie sulla procedura per mantenere la madre rilassata.
2. Far estrarre il latte alla madre utilizzando un tiralatte elettrico in un contenitore sterilizzato sotto la supervisione dell'infermiera responsabile dell'unità, seguendo gli standard igienici locali stabiliti da ciascun reparto maternità.
3. Dopo la raccolta, etichettare il contenitore contenente il latte con le informazioni della madre, la data e l'ora della raccolta. Conservare il latte materno (MOM) a una temperatura di -4 °C o inferiore per un massimo di 12 ore.

2. Scongelamento del latte di donazione pastorizzato (PDM)

NOTA: Gli HMB hanno una propria scorta di PDM, congelati ad una temperatura inferiore a -4 °C per un periodo massimo fino a 6 mesi, e la procedura è ben descritta in letteratura altrove 12,13,14.

1. Scongelare il latte crudo o PDM conservato in contenitori di vetro sterilizzati con coperchi di plastica a bagnomaria a 40 °C, garantendo il mantenimento della temperatura e un tempo di lavorazione più breve.
   NOTA: Non scongelare il PDM a temperatura ambiente o a temperatura di refrigerazione (all'interno del frigorifero), poiché i tempi di scongelamento in questi casi sono prolungati, il che favorisce l'esposizione e la crescita microbica.
2. Togliere le bottiglie di latte umano dal bagnomaria prima che il latte nel biberon raggiunga una temperatura superiore a 5 °C.

3. Inoculazione di PDM con MOM per la ricostituzione del microbioma

NOTA: Il rapporto volumetrico standard per il processo di inoculazione della PDM con MOM è 90%: 10% (v/v). Le fasi della procedura sono le seguenti:

1. Istruire il tecnico a indossare un camice da laboratorio, una maschera, un berretto e guanti.
2. Pulire la superficie di lavoro con una soluzione per la pulizia delle superfici seguendo il protocollo istituzionale locale.
3. Predisporre i materiali da utilizzare e preparare l'attrezzatura. Preriscaldare l'incubatrice (bagnomaria) con acqua a 37 °C.
4. Pianificare il volume finale di latte inoculato da utilizzare e selezionare un contenitore di dimensioni adeguate. Posizionare il contenitore con il MOM grezzo fresco e il PDM in forma liquida sul piano di lavoro.
5. Raccogliere un'aliquota fino a 1 mL di MOM utilizzando apparecchiature sterili per il successivo sequenziamento 16S e la conta batterica. Conservare l'aliquota in una crioprovetta priva di DNasi/RNasi a -80 °C.
6. Trasferire il volume rimanente, pari al 10% del volume finale di latte desiderato, utilizzando uno strumento volumetrico sterile (ad esempio siringa, pipetta) in un contenitore per alimenti da immergere in un bagno d'acqua a 37 °C.
7. Raccogliere un'aliquota di 1 mL di PDM utilizzando apparecchiature sterili per il successivo sequenziamento 16S e la conta batterica. Conservare l'aliquota in una crioprovetta priva di DNasi/RNasi a -80 °C.
8. Trasferire una quantità di PDM equivalente al 90% del volume finale di latte desiderato utilizzando uno strumento volumetrico sterile (ad es. siringa, pipetta) nel contenitore con il MOM del passaggio precedente, formando ora il latte materno inoculato (IM).
9. Sigillare il contenitore con un coperchio che impedisca a qualsiasi liquido esterno di contaminare l'interno del biberon e immergerlo nel bagnomaria a 37 °C per 4 h per permettere ai microrganismi inoculati nel latte di moltiplicarsi.
10. Dopo 4 ore, rimuovere il contenitore con l'IM fermentato dal bagnomaria, ora chiamato latte ricostituito (RM).
11. Riservare un'aliquota fino a 1 mL utilizzando apparecchiature sterili per il successivo sequenziamento 16S e la conta batterica. Conservare l'aliquote in una crioprovetta priva di DNasi/RNasi a -80 °C.
12. Trasferire il volume rimanente in un contenitore igienizzato per l'alimentazione dei neonati.

4. Validazione del metodo mediante coltura batterica su piastre

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili per prevenire la contaminazione e garantire l'accuratezza delle diluizioni. La crescita batterica può essere stimata utilizzando i metodi descritti altrove ^9,15.

1. Preparare diluizioni seriali di ciascun campione di latte (PDM, MOM, IM, RM) in soluzione fisiologica sterile a concentrazioni di ^10-1, ^10-2, ^10-3 e ^10-4 . Miscelare accuratamente ogni diluizione per garantire una distribuzione uniforme dei batteri.
2. Pippete e distribuire 100 μl di ciascun campione diluito su piastre di Man-Rogosa-Sharpe (MRS) e Mannitol Salt Agar (MSA) in triplicati, utilizzando un anello di Drigalski sterile o uno spalmatore di vetro. Assicurarsi che il volume sia distribuito uniformemente sulla piastra di agar.
3. Incubare le piastre di agar MRS in un barattolo anaerobico contenente per creare un ambiente a basso contenuto di ossigeno per la crescita dei batteri lattici.
4. Incubare le piastre di Mannitolo Salt Agar (MSA) in modo aerobico per supportare la crescita delle specie di Staphylococcus.
5. Incubare le piastre a 37 ± 2 °C per 48-72 h.
6. Selezionare la diluizione con un numero numerabile di colonie batteriche (25-250 colonie) su ogni tipo di agar
7. Contare le colonie visibili su ciascuna delle tre piastre replicate per la diluizione selezionata.
8. Calcolare la conta media delle colonie da piastre triplicate per la diluizione selezionata in terreni MRS e MSA.
9. Determinare il numero di unità formanti colonie (CFU) per ml per ciascun campione utilizzando la seguente formula e convertire in una scala logaritmica in base 10 (log10) per facilitare l'interpretazione. Procedere con l'analisi statistica dei risultati.
   Numero di CFU/mL = Numero di colonie × fattore di diluizione totale/volume placcato in mL

5. Analisi del microbioma del latte

NOTA: L'analisi del microbioma del latte può essere eseguita secondo i metodi e la pipeline descritti altrove¹⁶. Uno screenshot dello script R usato in questa analisi è presentato nella Figura S1 supplementare.

1. Centrifugare 500 μl del campione per 15 s a 180 × g per sedimentare le celle e il particolato.
2. Raccogliere 350 μl di surnatante e utilizzarlo per l'estrazione del DNA.
3. Quantificare il DNA estratto utilizzando uno spettrofotometro.
4. Amplificare le regioni V3 e V4 dell'RNA ribosomiale 16S utilizzando 20 ng di DNA e i primer 357F/805R (vedi Tabella dei materiali)¹⁷.
5. Utilizzare perle magnetiche per purificare gli ampliconi risultanti e quantificare gli ampliconi con codice a barre utilizzando un fluorimetro per DNA.
6. Sequenziare gli ampliconi in modalità paired-end 250 bp.
7. Elaborare le sequenze risultanti eseguendo il taglio di qualità e la rimozione dell'adattatore¹⁸. Utilizza la modalità PE (Paired-End Mode) con il punteggio Phred33 e imposta una lunghezza di lettura minima di 200 bp per garantire letture di alta qualità.
8. Importa i dati della sequenza paired-end in QIIME 2¹⁹ utilizzando un formato di file manifest e il comando: qiime tools import.
9. Processa le sequenze importate con DADA2 per il denoising, la dereplicazione e la rimozione della chimera utilizzando il comando: qiime dada2 denoise-paired. Questo passaggio genera sequenze rappresentative di alta qualità e una tabella delle funzionalità.
10. Filtra le funzioni e le sequenze per conservare solo quelle con una rappresentazione sufficiente utilizzando i comandi: qiime feature-table filter-features e qiime feature-table filter-seqs.
11. Preparare un database di riferimento estraendo le regioni amplificate dai primer (V3-V4) utilizzando: qiime feature-classifier extract-reads.
12. Utilizzare l'algoritmo VSEARCH per la classificazione tassonomica con il database di riferimento Silva a una soglia di identità del 97% eseguendo il comando:
    qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch
13. Integra le assegnazioni tassonomiche con la tabella delle funzionalità utilizzando gli strumenti BIOM: biom add-metadata.
14. Eseguire analisi statistiche come descritto altrove^20,21.

Risultati

Analisi della crescita batterica mediante coltura su piastra
I test microbiologici condotti per convalidare il metodo di inoculazione della PDM con il MOM, come proposto da Cacho et ^al.9, hanno dimostrato che, sulla base della conta CFU/mL, non c'erano differenze significative tra i campioni di latte inoculati prima e dopo l'incubazione di 4 ore. Tuttavia, in questi due punti temporali sono state osservate differenze nel numero di colonie, che ...

Discussione

Qui presentiamo un protocollo da applicare negli ospedali di maternità associati a una banca del latte umano, con l'obiettivo di fornire a PDM la ricostituzione del microbiota del latte da una madre specifica che, per vari motivi, non può fornire latte sufficiente al suo neonato. Il protocollo è semplice e si basa essenzialmente su due passaggi. La prima prevede l'applicazione di procedure eseguite di routine nelle banche del latte umano per la corretta raccolta e successiva pastorizz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC