인간 모유 미생물총(Human Milk Microbiota)의 개별화된 재구성: 실제 환경에서 실현 가능한 접근 방식

요약

이 논문은 실제 환경에서 모체 자신의 모유 미생물총(milk microbiota)을 사용하여 저온 살균된 기증자 우유 미생물총(microbiota)을 재구성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 효과적인 박테리아 성장 및 마이크로바이옴 조절을 입증하여 산부인과 병원 및 관련 모유 은행의 일상적인 치료에서 이 절차의 실현 가능한 적용을 지원합니다.

초록

산모 우유(MOM)는 신생아를 위한 가장 완벽한 영양 자원입니다. 산모가 충분한 모유를 생산할 수 없거나 모유 수유를 할 수 없는 경우, 선호되는 대안은 모유 은행에서 일상적으로 제공하는 저온 살균 기증자 모유(PDM)입니다. PDM은 시판되는 어떤 포뮬러보다 우수한 범위의 영양 및 면역학적 요소를 제공합니다. 그러나 생물학적 안전성을 보장하기 위해 PDM은 공생 미생물총(comensal microbiota)을 비활성화하고 특정 생체 활성 화합물을 감소시키는 과정인 저온 살균을 거칩니다. 이 연구는 MOM을 미생물 공급원으로 사용하여 PDM의 미생물군을 복원하도록 설계된 프로토콜을 제시하여 실제 임상 환경에 접근 방식을 적용합니다.

이 프로토콜은 산부인과 병원 및 관련 모유 은행에서 실시한 임상 시험에서 구현되었으며, 산모가 충분한 모유를 생산할 수 없는 조산아에게 맞춤형 기증자 모유를 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 방법론은 PDM에 MOM의 10%를 접종한 다음 37°C에서 4시간 동안 배양하는 것입니다. 미생물 분석은 배양 후 접종된 우유(IM)에서 성공적인 박테리아 성장을 입증했으며, 재구성된 우유(RM)의 미생물군 프로필이 MOM의 프로필과 매우 유사하여 효과적인 미생물군 복원을 나타냅니다. 이러한 결과는 재구성 프로토콜이 PDM의 영양 및 면역학적 품질을 향상시켜 모유를 먹지 않는 신생아의 건강과 발달을 지원할 수 있는 잠재력과 함께 신생아 치료에 구현될 수 있음을 시사합니다.

서문

모유는 신생아를 위한 최고의 영양 공급원으로 널리 알려져 있으며, 필수 거대 영양소 및 미량 영양소뿐만 아니라 다양한 대사 산물 및 항체, 사이토카인, 세포와 같은 면역 체계 구성 요소를 포함한 복잡한 요소 배열을 제공합니다¹. 또한, 모유의 유익한 특성은 공생 미생물 군집에서도 발생합니다. 모유의 이러한 모든 요소는 신생아의 발달에 중요한 역할을 한다¹. 미생물총(microbiota)으로 알려진 미생물 군집은 식단, 산모의 생활 방식, 분만 유형, 재태 연령과 같은 요인의 조합에 의해 영향을 받기 때문에 각 우유는 특정 특성을 가진 미생물총(microbiota)을 갖게 됩니다². 모유 미생물총(microbiota)이 신생아 발달에 도움이 되는 메커니즘은 공생 박테리아에 의한 집락화를 통한 장 표면 보호에서부터 장내 면역 세포와 상호 작용하는 대사 산물 생성을 통한 면역 체계 성숙 촉진에 이르기까지 다양하다³. 이러한 이유로, 각 모유에 함유된 미생물의 개별화된 프로필은 신생아를 위한 맞춤형 의약품의 한 형태가 된다⁴.

건강한 미생물총(microbiota)의 존재는 생태학적 틈새를 차지하고 영양을 지원함으로써 잠재적인 병원성 미생물에 의한 집락화로부터 신생아를 보호하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 병원 환경에 있고 미성숙한 면역 체계를 가지고 있기 때문에 이러한 외부 영향에 더 취약한 미숙아의 경우 영양을 지원할 수 있습니다. 더욱이, 조산한 산모는 신생아를 위해 충분한 양의 모유를 생산하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 모유 생산량은 일반적으로 재태 연령이 어릴수록 낮다⁵. 이러한 경우 신생아에게 수유하는 가장 좋은 방법은 HMB(Human Milk Banks)에서 제공하는 저온 살균 기증자 우유입니다⁶.

브라질은 세계에서 가장 크고 광범위한 HMB 네트워크를 보유하고 있습니다⁷. 이^{네트워크는 보건부}(Ministry of Health)7에서 관리하는 국가 통합 의료 시스템(Sistema Único de Saúde)을 통해 160,000L 이상의 저온 살균 기증자 모유(PDM)를 부모에게 무료로 수집, 준비 및 전국에 배포합니다. 저온 살균은 신생아를 위해 기증된 우유의 생물학적 안전성을 보장하는 데 필수적입니다. 이 과정은 일반적으로 생모유 기증자 모유 용기를 62.5°C의 수조에 30분 동안 담그는 홀더 방법을 사용하여 수행됩니다 ^6,8. 생성된 PDM은 소비할 준비가 될 때까지 냉장 보관됩니다. 그러나 저온 살균은 우유의 공생 미생물총(comensal microbiota)의 생존력을 감소시키고 다양한 생체 활성 성분의 생체 이용률을 감소시킵니다. 이는 저온 살균 공정이 병원성 미생물이 신생아에게 전염되는 것을 방지하기 위해 표준화되어 있기 때문입니다. 이러한 맥락에서 2017년 Cacho와 동료들은 PDM⁹에 다양한 비율로 접종하여 모유의 공생 미생물총(comensal microbiota)을 재구성할 수 있는 가능성을 설명했습니다. 이들의 연구 결과는 모유(MOM)의 10% 농도를 사용하는 것이 MOM 마이크로바이옴 프로필의 원래 구성을 유지하기 위한 최적의 농도임을 보여주었습니다. 이 접근법은 특정 박테리아의 과다 증식 위험을 줄이며, 이는 일반적으로 공생적이지만 재구성된 우유에 불균형적으로 존재할 경우 해로울 수 있습니다. 특히, 이 연구는 4시간 동안 배양한 1:10 희석(10% MOM + 90% PDM)이 희석되지 않은 MOM에서 발견되는 것의 약 60%인 균형 잡힌 박테리아 부하를 초래하는 것을 관찰했으며, 이는 더 안전하고 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 대조적으로, 3:10과 같은 높은 희석은 과도한 박테리아 성장으로 이어졌으며, 이는 안전성을 보장하기 위해 제어된 농도 및 조건의 필요성이 강조되었습니다.

이 기사에서는 PDM에서 모유 미생물군을 재구성하는 이 절차가 산부인과 병원 및 관련 모유 은행의 일상적인 진료 내에서 실제 상황에서 달성될 수 있음을 보여줍니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 당사 연구 그룹(Brazilian Registry of Clinical Trials, ReBEC RBR-729kr8x)이 수행한 임상시험 절차의 일부로 수행되었으며, 윤리 위원회의 승인(프로세스 CAAE nº 41063520.4.0 000.0121)을 받았으며 무작위 배정 및 샘플 수집 전에 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었습니다.

우유 미생물총(microbiota)을 재구성하는 절차는 세 단계로 수행됩니다.

1. 어미의 생우유를 입수하는 것

참고: 우유를 얻는 절차는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다^10,11.

1. 시술 전에 윤리 위원회에 따라 산모로부터 정보에 입각한 동의를 얻고 산모를 편안하게 하기 위한 시술에 대한 의심, 우려, 두려움 및 불안을 해소하여 산모에게 할 모든 일을 설명해야 합니다.
2. 산모가 전기 유축기를 사용하여 각 산부인과 병동에서 정한 지역 위생 기준에 따라 병동 담당 간호사의 감독 하에 멸균된 용기에 젖을 짜도록 합니다.
3. 수유 후 모유가 들어 있는 용기에 산모의 정보, 수거 날짜 및 시간을 표시하십시오. 어미의 모유(MOM)를 -4°C 이하의 온도에서 최대 12시간 동안 보관하십시오.

2. 저온 살균 기증자 우유 해동(PDM)

참고: HMB는 최대 6개월 동안 -4°C 미만의 온도에서 냉동된 자체 PDM 재고를 보유하고 있으며 절차는 다른 문헌 12,13,14에 잘 설명되어 있습니다.

1. 플라스틱 뚜껑이 있는 멸균 유리 용기에 보관된 원유 또는 PDM을 40°C의 수조에서 해동하여 온도를 유지하고 처리 시간을 단축할 수 있습니다.
   알림: PDM을 실온 또는 냉장 온도(냉장고 내부)에서 해동하지 마십시오., 이러한 경우 해동 시간이 길어져 미생물 노출 및 성장을 촉진합니다.
2. 병의 우유가 5°C 이상의 온도에 도달하기 전에 수조에서 인간 우유병을 제거하십시오.

3. 마이크로바이옴 재구성을 위한 PDM과 MOM 접종

참고: PDM에 MOM을 접종하는 과정의 표준 부피 비율은 90%: 10%(v/v)입니다. 절차의 단계는 다음과 같습니다.

1. 기술자에게 실험복, 마스크, 모자 및 장갑을 착용하도록 지시합니다.
2. 지역 기관 프로토콜에 따라 표면 세척 용액으로 작업 표면을 청소하십시오.
3. 사용할 재료를 정리하고 장비를 준비합니다. 인큐베이터(수조)를 물로 37°C로 예열합니다.
4. 사용할 접종 우유의 최종 부피를 계획하고 적절한 크기의 용기를 선택합니다. 신선한 원시 MOM과 PDM이 담긴 용기를 액체 형태로 작업 표면에 놓습니다.
5. 후속 16S 염기서열분석 및 박테리아 수를 위해 멸균 장비를 사용하여 최대 1mL의 MOM의 부분 표본을 수집합니다. DNase/RNase가 없는 극저온 튜브에 -80 °C의 부분 표본을 보관합니다.
6. 멸균 부피 측정 기기(예: 주사기, 피펫)를 사용하여 최종 원하는 우유 부피의 10%에 해당하는 나머지 부피를 식품 안전 용기에 옮겨 37°C의 수조에 담급니다.
7. 후속 16S 염기서열분석 및 박테리아 수를 위해 멸균 장비를 사용하여 PDM의 1mL 분취액을 수집합니다. DNase/RNase가 없는 극저온 튜브에 -80 °C의 부분 표본을 보관합니다.
8. 멸균 부피 측정 기기(예: 주사기, 피펫)를 사용하여 최종 원하는 우유 부피의 90%에 해당하는 PDM의 양을 이전 단계의 MOM이 있는 용기로 옮기면 이제 접종된 모유(IM)가 형성됩니다.
9. 외부 액체가 병 내부를 오염시키지 않도록 용기를 뚜껑으로 밀봉하고 우유에 접종된 미생물이 증식할 수 있도록 37°C의 수조에 4시간 동안 담그십시오.
10. 4 시간 후, 발효 된 IM이 담긴 용기를 수조에서 제거하며, 현재 재구성 우유 (RM)라고 합니다.
11. 후속 16S 염기서열분석 및 박테리아 계수를 위해 멸균 장비를 사용하여 최대 1mL의 부분 표본을 예약합니다. 부분 표본 저장고를 DNase/RNase가 없는 극저온 튜브에 -80 °C에서 보관합니다.
12. 남은 부피는 신생아 수유를 위해 소독된 용기에 옮깁니다.

4. 플레이트에서 박테리아 배양에 의한 방법의 검증

참고: 모든 절차는 오염을 방지하고 희석의 정확성을 보장하기 위해 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 박테리아 성장은 다른 곳에 기술된 방법을 사용하여 추정할 수 있다 ^9,15.

1. 멸균 식염수에 각 우유 샘플(PDM, MOM, IM, RM)을 10-1, ^10-2, ^10-3 및 ^10-4 농도로 연속 희석합니다. 균일한 박테리아 분포를 보장하기 위해 각 희석액을 철저히 혼합하십시오.
2. 멸균 Drigalski 루프 또는 유리 스프레더를 사용하여 각 희석된 시료 100μL를 Man-Rogosa-Sharpe(MRS) 및 Mannitol Salt Agar(MSA) 플레이트에 3회씩 피펫으로 펴 바릅니다. 볼륨이 한천 플레이트에 균일하게 퍼져 있는지 확인하십시오.
3. MRS 한천 플레이트를 젖산 박테리아 성장을 위한 저산소 환경을 조성하기 위해 포함된 혐기성 용기에 배양합니다.
4. 만니톨 소금 한천(MSA) 플레이트를 호기적으로 배양하여 포도상구균 종의 성장을 지원합니다.
5. 플레이트를 37 ± 2 ° C에서 48-72 시간 동안 배양합니다.
6. 각 유형의 한천에서 셀 수 있는 수의 박테리아 콜로니(25-250 콜로니)로 희석을 선택합니다.
7. 선택한 희석액에 대해 3개의 복제 플레이트 각각에서 보이는 콜로니를 계산합니다.
8. MRS 및 MSA 배지 모두에서 선택한 희석액에 대한 3중 플레이트의 평균 콜로니 수를 계산합니다.
9. 다음 공식을 사용하여 각 샘플에 대한 mL당 집락 형성 단위(CFU) 수를 결정하고 해석을 용이하게 하기 위해 base-10 로그 스케일(log10)로 변환합니다. 결과의 통계 분석을 진행합니다.
   CFU/mL 수 = 총 희석 계수/도금된 부피(mL)× 콜로니 수

5. 우유 마이크로바이옴 분석

참고: 우유 마이크로바이옴 분석은 다른 문헌¹⁶에 설명된 방법 및 파이프라인에 따라 수행할 수 있습니다. 이 분석에 사용된 R 스크립트의 스크린샷은 보충 그림 S1에 나와 있습니다.

1. 시료 500μL를 180 × g 에서 15초 동안 원심분리하여 세포와 미립자를 침전시킵니다.
2. 상층액 350μL를 수집하여 DNA 추출에 사용합니다.
3. 분광 광도계를 사용하여 추출된 DNA를 정량화합니다.
4. 20ng의 DNA와 프라이머 357F/805R을 사용하여 16S 리보솜 RNA의 V3 및 V4 영역을 증폭합니다( 재료 표 참조)¹⁷.
5. 마그네틱 비드를 사용하여 생성된 앰플리콘을 정제하고 DNA 형광측정기를 사용하여 바코드 앰플리콘을 정량화합니다.
6. paired-end 250 bp 모드에서 앰플리콘을 시퀀싱합니다.
7. 품질 트리밍 및 어댑터 제거를 수행하여 결과 시퀀스를 처리합니다¹⁸. Phred33 스코어링과 함께 PE(Paired-End Mode)를 사용하고 최소 판독 길이를 200bp로 설정하여 고품질 판독을 보장합니다.
8. 매니페스트 파일 형식과 qiime tools import 명령을 사용하여 쌍단 시퀀스 데이터를 QIIME^{2 19} 로 가져옵니다.
9. qiime dada2 denoise-paired 명령을 사용하여 노이즈 제거, 복제 제거 및 키메라 제거를 위해 가져온 시퀀스를 DADA2로 처리합니다. 이 단계에서는 고품질 대표 시퀀스와 기능 테이블을 생성합니다.
10. qiime feature-table filter-features 및 qiime feature-table filter-seqs 명령을 사용하여 충분한 표현을 가진 항목만 유지하도록 기능 및 시퀀스를 필터링합니다.
11. qiime feature-classifier extract-reads를 사용하여 프라이머(V3-V4)에 의해 증폭된 영역을 추출하여 참조 데이터베이스를 준비합니다.
12. 다음 명령을 실행하여 97% ID 임계값에서 Silva 참조 데이터베이스와 함께 분류 분류를 위한 VSEARCH 알고리즘을 사용합니다.
    qiime 기능 분류자 classify-consensus-vsearch
13. BIOM 도구(biom add-metadata)를 사용하여 분류 할당을 기능 테이블과 통합합니다.
14. 다른 곳에서 설명한 대로 통계 분석을 수행한다 ^20,21.

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결과

플레이트 배양에 의한 박테리아 성장 분석
Cacho et ^al.9이 제안한 바와 같이 MOM을 PDM에 접종하는 방법을 검증하기 위해 수행된 미생물 검사는 CFU/mL 수를 기반으로 4시간 배양 전과 후에 접종된 우유 샘플 간에 유의미한 차이가 없음을 입증했습니다. 그러나 이 두 시점에서 콜로니 수의 차이가 관찰되었으며, 이는 포도상구균 종(Staphylococcus...

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토론

여기에서는 모유 은행과 연계된 산부인과 병원에 적용할 수 있는 프로토콜을 제시하며, 여러 가지 이유로 신생아에게 충분한 모유를 공급할 수 없는 특정 산모의 모유 미생물총(microbiota)을 PDM에 제공하는 것을 목표로 합니다. 프로토콜은 간단하며 기본적으로 두 단계를 기반으로 합니다. 첫 번째는 기증자 모유의 적절한 수집 및 후속 저온 살균을 위해 인간 모유 은행에?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC