Reconstituição individualizada da microbiota do leite humano: uma abordagem viável em ambientes do mundo real

Resumo

O artigo descreve um protocolo para reconstituir a microbiota de leite doado pasteurizado usando a microbiota do leite materno em ambientes práticos do mundo real. Demonstra crescimento bacteriano efetivo e modulação do microbioma, apoiando a aplicação viável desse procedimento dentro dos cuidados de rotina de uma maternidade e seu banco de leite humano associado.

Resumo

O leite materno (MOM) é o recurso nutricional mais completo para recém-nascidos. Nos casos em que as mães não conseguem produzir leite suficiente ou não podem amamentar, a alternativa preferida é o leite humano doado pasteurizado (PDM), que é rotineiramente fornecido por bancos de leite humano. O PDM oferece uma gama superior de elementos nutricionais e imunológicos em comparação com qualquer fórmula disponível comercialmente. No entanto, para garantir a biossegurança, o PDM passa por pasteurização, processo que inativa a microbiota comensal e reduz certos compostos bioativos. Este estudo apresenta um protocolo projetado para restaurar a microbiota do PDM usando MOM como fonte microbiana, adaptando a abordagem a um ambiente clínico do mundo real.

O protocolo foi implementado em um ensaio clínico realizado em uma maternidade e seu banco de leite humano associado, com o objetivo de fornecer leite doado personalizado para bebês prematuros cujas mães não conseguem produzir leite suficiente. A metodologia envolve a inoculação do PDM com 10% de MOM, seguida de incubação a 37 °C por 4 h. A análise microbiológica demonstrou crescimento bacteriano bem-sucedido no leite inoculado (IM) após a incubação, com o perfil da microbiota do leite reconstituído (MR) muito semelhante ao do MOM, indicando uma restauração eficaz da microbiota. Esses resultados sugerem que o protocolo de reconstituição é viável para implementação na assistência neonatal, com potencial para melhorar a qualidade nutricional e imunológica do PDM, auxiliando na saúde e no desenvolvimento de recém-nascidos não amamentados.

Introdução

O leite materno é amplamente reconhecido como a melhor fonte de nutrição para recém-nascidos, fornecendo não apenas macro e micronutrientes essenciais, mas também uma complexa variedade de elementos, incluindo vários metabólitos e componentes do sistema imunológico, como anticorpos, citocinas e células¹. Além disso, as propriedades benéficas do leite materno também surgem de uma comunidade de microrganismos comensais. Todos esses elementos do leite materno desempenham um papel crucial no desenvolvimento do recém-nascido^. A comunidade de microrganismos, conhecida como microbiota, é influenciada por uma combinação de fatores como dieta, estilo de vida materno, tipo de parto e idade gestacional, fazendo com que cada leite tenha uma microbiota com características particulares². Os mecanismos pelos quais a microbiota do leite materno beneficia o desenvolvimento neonatal vão desde a proteção da superfície entérica por meio da colonização por bactérias comensais até a promoção da maturação do sistema imunológico por meio da produção de metabólitos que interagem com as células imunes no intestino³. Por esse motivo, o perfil individualizado de microrganismos no leite materno o torna uma forma de medicina personalizada para recém-nascidos⁴.

A presença de uma microbiota saudável pode ajudar a proteger o recém-nascido contra a colonização por microrganismos potencialmente patogênicos, ocupando o nicho ecológico e apoiando a nutrição, especialmente para prematuros, que são mais vulneráveis a esses impactos externos por estarem em ambiente hospitalar e terem um sistema imunológico imaturo. Além disso, as mães que dão à luz prematuramente muitas vezes têm dificuldade em produzir leite em quantidades suficientes para seus recém-nascidos. A produção de leite é tipicamente menor quanto mais jovem a idade gestacional⁵. Nesses casos, a melhor opção para a alimentação do recém-nascido é o leite doado pasteurizado fornecido pelos Bancos de Leite Humano (BLH)⁶.

O Brasil possui a maior e mais extensa rede de BLHs do mundo⁷. Essa rede coleta, prepara e distribui mais de 160.000 L de leite humano doado pasteurizado (PDM) em todo o país, sem custo para os pais, por meio do Sistema Único de Saúde, gerenciado pelo Ministério da Saúde⁷. A pasteurização é essencial para garantir a biossegurança do leite doado destinado aos recém-nascidos. Esse processo geralmente é realizado pelo método Holder, que envolve a imersão de um recipiente de leite materno cru de doadora em banho-maria a 62,5 °C por 30 min ^6,8. O PDM resultante é então armazenado sob refrigeração até que esteja pronto para consumo. No entanto, a pasteurização reduz a viabilidade da microbiota comensal do leite e diminui a biodisponibilidade de vários componentes bioativos. Isso ocorre porque o processo de pasteurização é padronizado para evitar a transmissão de microrganismos patogênicos para o recém-nascido. Nesse contexto, em 2017, Cacho e colegas descreveram a possibilidade de reconstituir a microbiota comensal do próprio leite materno, inoculando-o em várias proporções no PDM⁹. Suas descobertas demonstraram que o uso de uma concentração de 10% do leite materno (MOM) é a concentração ideal para manter a composição original do perfil do microbioma MOM. Essa abordagem reduz o risco de crescimento excessivo de bactérias específicas, que, embora tipicamente comensais, podem se tornar prejudiciais se estiverem desproporcionalmente presentes no leite reconstituído. Especificamente, o estudo observou que uma diluição de 1:10 (10% MOM + 90% PDM), incubada por 4 h, resultou em uma carga bacteriana bem equilibrada - aproximadamente 60% daquela encontrada em MOM não diluída - indicando uma abordagem mais segura e eficaz. Em contraste, diluições mais altas, como 3:10, levaram ao crescimento bacteriano excessivo, destacando a necessidade crítica de concentrações e condições controladas para garantir a segurança.

Neste artigo, demonstramos que esse procedimento de reconstituição da microbiota do leite materno no PDM pode ser realizado em situações do mundo real dentro dos cuidados de rotina de uma maternidade e seu banco de leite humano associado.

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Protocolo

Este protocolo foi realizado como parte dos procedimentos de um ensaio clínico conduzido por nosso grupo de pesquisa (Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos, ReBEC RBR-729kr8x), e recebeu aprovação do Comitê de Ética (processo CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) e o consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da randomização e coleta da amostra.

O procedimento de reconstituição da microbiota do leite é feito em três etapas:

1. Obtenção de leite cru materno

NOTA: O procedimento para obtenção de leite pode ser encontrado em outro artigo^10,11.

1. Antes do procedimento, obtenha o consentimento informado da mãe de acordo com o comitê de ética e certifique-se de explicar tudo o que será feito à mãe, abordando quaisquer dúvidas, preocupações, medos e ansiedades sobre o procedimento para manter a mãe relaxada.
2. Fazer com que a mãe extraia leite usando uma bomba tira leite elétrica em um recipiente esterilizado sob a supervisão da enfermeira responsável pela unidade, seguindo os padrões de higiene locais estabelecidos em cada maternidade.
3. Após a coleta, rotule o recipiente contendo o leite com as informações da mãe, data e hora da coleta. Mantenha o leite materno (MOM) a uma temperatura de -4 °C ou inferior por até 12 h.

2. Descongelamento do leite pasteurizado de doador (PDM)

NOTA: Os BLHs possuem estoque próprio de PDM, congelado a temperatura abaixo de -4 °C por um período máximo de até 6 meses, e o procedimento é bem descrito na literatura em outros lugares 12,13,14.

1. Descongele o leite cru ou PDM armazenado em recipientes de vidro esterilizado com tampas de plástico em banho-maria a 40 °C, garantindo a manutenção da temperatura e um menor tempo de processamento.
   NOTA: Não descongele o PDM à temperatura ambiente ou à temperatura de refrigeração (dentro do frigorífico), pois os tempos de descongelação nestes casos são prolongados, o que promove a exposição e o crescimento microbiano.
2. Remova as garrafas de leite humano do banho-maria antes que o leite na garrafa atinja uma temperatura acima de 5 °C.

3. Inoculação de PDM com MOM para reconstituição do microbioma

NOTA: A proporção volumétrica padrão para o processo de inoculação de PDM com MOM é de 90%: 10% (v/v). As etapas do procedimento são as seguintes:

1. Instrua o técnico a usar jaleco, máscara, touca e luvas.
2. Limpe a superfície de trabalho com uma solução de limpeza de superfície seguindo o protocolo institucional local.
3. Organize os materiais a serem utilizados e prepare o equipamento. Pré-aqueça a incubadora (banho-maria) com água a 37 °C.
4. Planeje o volume final de leite inoculado a ser usado e selecione um recipiente de tamanho apropriado. Coloque o recipiente com MOM fresco e o PDM na forma líquida na superfície de trabalho.
5. Colete uma alíquota de até 1 mL do MOM usando equipamento estéril para sequenciamento subsequente de 16S e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
6. Transfira o volume restante, equivalente a 10% do volume final desejado de leite, usando um instrumento volumétrico estéril (por exemplo, seringa, pipeta) para um recipiente próprio para alimentos para ser imerso em banho-maria a 37 °C.
7. Colete uma alíquota de 1 mL do PDM usando equipamento estéril para sequenciamento 16S subsequente e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
8. Transferir uma quantidade de PDM equivalente a 90% do volume final desejado de leite usando instrumento volumétrico estéril (por exemplo, seringa, pipeta) para o recipiente com o MOM da etapa anterior, formando agora o leite materno inoculado (IM).
9. Feche o recipiente com uma tampa que evite que qualquer líquido externo contamine o interior da garrafa e mergulhe-o no banho-maria a 37 °C por 4 h para permitir que os microrganismos inoculados no leite se multipliquem.
10. Após 4 h, retire o recipiente com o IM fermentado do banho-maria, agora chamado de leite reconstituído (RM).
11. Reserve uma alíquota de até 1 mL usando equipamento estéril para sequenciamento 16S subsequente e contagem bacteriana. Armazenar a alíquota num criotubo isento de DNase/RNase a -80 °C.
12. Transfira o volume restante para um recipiente higienizado para alimentar os recém-nascidos.

4. Validação do método por cultura bacteriana em placas

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis para evitar contaminação e garantir a precisão das diluições. O crescimento bacteriano pode ser estimado usando métodos descritos em outro^{artigo 9,15}.

1. Prepare diluições seriadas de cada amostra de leite (PDM, MOM, IM, RM) em solução salina estéril nas concentrações de ^10-1, ^10-2, ^10-3 e ^10-4 . Misture bem cada diluição para garantir uma distribuição bacteriana uniforme.
2. Pipete e espalhe 100 μL de cada amostra diluída em placas de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) e Mannitol Salt Agar (MSA) em triplicatas, usando um laço Drigalski estéril ou espalhador de vidro. Certifique-se de que o volume esteja uniformemente espalhado na placa de ágar.
3. Incube placas de ágar MRS em um frasco anaeróbico contendo para criar um ambiente com baixo teor de oxigênio para o crescimento de bactérias do ácido lático.
4. Incubar placas de ágar sal de manitol (MSA) aeróbicas para apoiar o crescimento de espécies de Staphylococcus.
5. Incubar as placas a 37 ± 2 °C durante 48-72 h.
6. Selecione a diluição com um número contável de colônias bacterianas (25-250 colônias) em cada tipo de ágar
7. Contar as colónias visíveis em cada uma das três placas replicadas para a diluição seleccionada.
8. Calcular a contagem média de colónias a partir de placas triplicadas para a diluição seleccionada nos meios MRS e MSA.
9. Determine o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mL para cada amostra usando a fórmula a seguir e converta para uma escala logarítmica de base 10 (log10) para facilitar a interpretação. Prossiga com a análise estatística dos resultados.
   Número de UFC/ml = Número de colónias × factor de diluição total/volume plaqueado em ml

5. Análise do microbioma do leite

NOTA: A análise do microbioma do leite pode ser realizada de acordo com os métodos e pipeline descritos em outro lugar¹⁶. Uma captura de tela do script R usado nesta análise é apresentada na Figura Suplementar S1.

1. Centrifugar 500 μL da amostra durante 15 s a 180 × g para sedimentar as células e as partículas.
2. Colete 350 μL do sobrenadante e use-o para extração de DNA.
3. Quantificar o ADN extraído utilizando um espectrofotómetro.
4. Amplificar as regiões V3 e V4 do RNA ribossômico 16S usando 20 ng de DNA e primers 357F / 805R (ver Tabela de Materiais) ¹⁷ .
5. Use esferas magnéticas para purificar os amplicons resultantes e quantificar os amplicons com código de barras usando um fluorímetro de DNA.
6. Sequencie os amplicons no modo de extremidade emparelhada de 250 bp.
7. Processe as sequências resultantes executando o corte de qualidade e a remoção do adaptador¹⁸. Use o modo de extremidade emparelhada (PE) com pontuação Phred33 e defina um comprimento mínimo de leitura de 200 bp para garantir leituras de alta qualidade.
8. Importe dados de sequência de extremidade emparelhada para o QIIME 2¹⁹ usando um formato de arquivo de manifesto e o comando: qiime tools import.
9. Processe as sequências importadas com DADA2 para remoção de ruído, desreplicação e quimera usando o comando: qiime dada2 denoise-paired. Esta etapa gera sequências representativas de alta qualidade e uma tabela de recursos.
10. Filtre recursos e sequências para reter apenas aqueles com representação suficiente usando os comandos: qiime feature-table filter-features e qiime feature-table filter-seqs.
11. Prepare um banco de dados de referência extraindo regiões amplificadas pelos primers (V3-V4) usando: qiime feature-classifier extract-reads.
12. Use o algoritmo VSEARCH para classificação taxonômica com o banco de dados de referência Silva em um limite de identidade de 97% executando o comando:
    qiime classificador de recursos classificar-consenso-vsearch
13. Integre atribuições taxonômicas com a tabela de recursos usando ferramentas BIOM: biom add-metadata.
14. Realizar análises estatísticas conforme descrito em outro artigo ^20,21.

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Resultados

Análise do crescimento bacteriano por cultura em placas
Os testes microbiológicos realizados para validar o método de inoculação do PDM com o MOM, conforme proposto por Cacho et ^al.9, demonstraram que, com base na contagem de UFC/mL, não houve diferenças significativas entre as amostras de leite inoculadas antes e após a incubação de 4 h. No entanto, diferenças no número de colônias foram observadas nesses dois momentos, indicando ...

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Discussão

Apresentamos aqui um protocolo a ser aplicado em maternidades associadas a um banco de leite humano, com o objetivo de proporcionar ao PDM a reconstituição da microbiota láctea de uma mãe específica que, por motivos diversos, não consegue fornecer leite suficiente ao seu recém-nascido. O protocolo é simples e essencialmente baseado em duas etapas. A primeira envolve a aplicação de procedimentos rotineiramente realizados em bancos de leite humano para a coleta adequada e posteri...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC