Individualisierte Rekonstitution der Mikrobiota der Muttermilch: Ein praktikabler Ansatz in der Praxis

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt ein Protokoll zur Rekonstitution pasteurisierter Spendermilch-Mikrobiota unter Verwendung der muttereigenen Milch-Mikrobiota in praktischen, realen Umgebungen. Es zeigt ein effektives Bakterienwachstum und eine effektive Mikrobiommodulation, was die praktikable Anwendung dieses Verfahrens in der Routineversorgung einer Entbindungsklinik und der zugehörigen Muttermilchbank unterstützt.

Zusammenfassung

Muttermilch (MOM) ist die vollständigste Nahrungsquelle für Neugeborene. In Fällen, in denen Mütter nicht in der Lage sind, ausreichend Milch zu produzieren oder nicht stillen können, ist die bevorzugte Alternative pasteurisierte Spendermilch (PDM), die routinemäßig von Muttermilchbanken zur Verfügung gestellt wird. PDM bietet eine überlegene Auswahl an ernährungsphysiologischen und immunologischen Elementen im Vergleich zu jeder kommerziell erhältlichen Formel. Um die Biosicherheit zu gewährleisten, wird PDM jedoch einer Pasteurisierung unterzogen, einem Prozess, der kommensale Mikrobiota inaktiviert und bestimmte bioaktive Verbindungen reduziert. In dieser Studie wird ein Protokoll vorgestellt, das entwickelt wurde, um die Mikrobiota von PDM unter Verwendung von MOM als mikrobielle Quelle wiederherzustellen und den Ansatz an ein reales klinisches Umfeld anzupassen.

Das Protokoll wurde in einer klinischen Studie umgesetzt, die in einer Entbindungsklinik und der zugehörigen Muttermilchbank durchgeführt wurde, mit dem Ziel, Frühgeborenen, deren Mütter nicht genügend Milch produzieren können, personalisierte Spendermilch zur Verfügung zu stellen. Die Methodik beinhaltet die Inokulation von PDM mit 10 % der MOM, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 4 Stunden. Die mikrobiologische Analyse zeigte ein erfolgreiches Bakterienwachstum in der inokulierten Milch (IM) nach der Inkubation, wobei das Mikrobiotaprofil der rekonstituierten Milch (RM) dem von MOM sehr ähnlich war, was auf eine effektive Wiederherstellung der Mikrobiota hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Rekonstitutionsprotokoll für die Implementierung in der Neugeborenenversorgung machbar ist, mit dem Potenzial, die ernährungsphysiologische und immunologische Qualität von PDM zu verbessern und dadurch die Gesundheit und Entwicklung von nicht gestillten Neugeborenen zu unterstützen.

Einleitung

Muttermilch ist weithin als die beste Nahrungsquelle für Neugeborene anerkannt und liefert nicht nur essentielle Makro- und Mikronährstoffe, sondern auch eine komplexe Reihe von Elementen, darunter verschiedene Metaboliten und Komponenten des Immunsystems wie Antikörper, Zytokine und Zellen¹. Darüber hinaus ergeben sich die vorteilhaften Eigenschaften der Muttermilch auch aus einer Gemeinschaft kommensaler Mikroorganismen. All diese Elemente der Muttermilch spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Neugeborenen¹. Die Gemeinschaft der Mikroorganismen, die als Mikrobiota bekannt ist, wird von einer Kombination von Faktoren wie Ernährung, Lebensstil der Mutter, Art der Geburt und Gestationsalter beeinflusst, was dazu führt, dass jede Milch eine Mikrobiota mit bestimmten Merkmalen aufweist². Die Mechanismen, durch die die Mikrobiota der Muttermilch die Entwicklung von Neugeborenen begünstigt, reichen vom Schutz der Darmoberfläche durch Besiedlung durch kommensale Bakterien bis hin zur Förderung der Reifung des Immunsystems durch die Produktion von Metaboliten, die mit Immunzellen im Darm interagieren³. Aus diesem Grund ist das individuelle Profil der Mikroorganismen in der Muttermilch eine Form der personalisierten Medizin für Neugeborene⁴.

Das Vorhandensein einer gesunden Mikrobiota kann dazu beitragen, das Neugeborene vor der Besiedlung durch potenziell pathogene Mikroorganismen zu schützen, indem es die ökologische Nische einnimmt und die Ernährung unterstützt, insbesondere für Frühgeborene, die aufgrund ihres Aufenthalts in einem Krankenhaus und eines unreifen Immunsystems anfälliger für diese äußeren Einflüsse sind. Darüber hinaus haben Mütter, die zu früh gebären, oft Schwierigkeiten, Milch in ausreichender Menge für ihre Neugeborenen zu produzieren. Die Milchproduktion ist in der Regel geringer, je jünger das Gestationsalter^{ist: 5} Jahre. In diesen Fällen ist die beste Option für die Fütterung des Neugeborenen pasteurisierte Spendermilch, die von Muttermilchbanken (HMB)⁶ bereitgestellt wird.

Brasilien verfügt über das größte und umfangreichste Netz von HMBs der Welt⁷. Dieses Netzwerk sammelt, bereitet auf und verteilt mehr als 160.000 Liter pasteurisierte Spendermilch (PDM) im ganzen Land, ohne dass den Eltern Kosten entstehen, und zwar über das nationale einheitliche Gesundheitssystem (Sistema Único de Saúde), das vom Gesundheitsministerium^{verwaltet wird 7}. Die Pasteurisierung ist unerlässlich, um die biologische Sicherheit der gespendeten Milch für Neugeborene zu gewährleisten. Dieser Vorgang wird in der Regel nach der Holder-Methode durchgeführt, bei der ein Behälter mit roher Spendermuttermilch 30 min lang in ein Wasserbad bei 62,5 °C getaucht^{wird 6,8}. Das resultierende PDM wird dann bis zum Verzehr gekühlt gelagert. Die Pasteurisierung verringert jedoch die Lebensfähigkeit der kommensalen Mikrobiota der Milch und verringert die Bioverfügbarkeit verschiedener bioaktiver Komponenten. Dies liegt daran, dass der Pasteurisierungsprozess standardisiert ist, um die Übertragung pathogener Mikroorganismen auf das Neugeborene zu verhindern. In diesem Zusammenhang beschrieben Cacho und Kollegen 2017 die Möglichkeit, die kommensale Mikrobiota der eigenen Muttermilch zu rekonstituieren, indem diese in verschiedenen Anteilen in PDM⁹ geimpft wird. Ihre Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung einer Konzentration von 10 % der Muttermilch (MOM) die optimale Konzentration ist, um die ursprüngliche Zusammensetzung des MOM-Mikrobiomprofils zu erhalten. Dieser Ansatz verringert das Risiko eines übermäßigen Wachstums bestimmter Bakterien, die zwar in der Regel kommensal, aber schädlich werden können, wenn sie in der rekonstituierten Milch unverhältnismäßig stark vorhanden sind. Insbesondere wurde in der Studie beobachtet, dass eine Verdünnung von 1:10 (10 % MOM + 90 % PDM), die 4 Stunden lang inkubiert wurde, zu einer ausgewogenen Bakterienlast führte – etwa 60 % der in unverdünntem MOM gefundenen – was auf einen sichereren und effektiveren Ansatz hinweist. Im Gegensatz dazu führten höhere Verdünnungen, wie z. B. 3:10, zu übermäßigem Bakterienwachstum, was die dringende Notwendigkeit kontrollierter Konzentrationen und Bedingungen unterstreicht, um die Sicherheit zu gewährleisten.

In diesem Artikel zeigen wir, dass dieses Verfahren zur Rekonstitution der Muttermilchmikrobiota in PDM in realen Situationen im Rahmen der Routineversorgung einer Entbindungsklinik und der zugehörigen Muttermilchbank erreicht werden kann.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde im Rahmen der Verfahren einer klinischen Studie durchgeführt, die von unserer Forschungsgruppe (Brasilianisches Register für klinische Studien, ReBEC RBR-729kr8x) durchgeführt wurde, und erhielt die Genehmigung der Ethikkommission (Prozess CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) und die Einverständniserklärung aller Teilnehmer vor der Randomisierung und Probenentnahme wurde eingeholt.

Das Verfahren zur Rekonstitution der Milchmikrobiota erfolgt in drei Schritten:

1. Rohmilch der Mutter gewinnen

HINWEIS: Das Verfahren zur Gewinnung von Milch finden Sie an anderer Stelle^10,11.

1. Holen Sie vor dem Eingriff die Einverständniserklärung der Mutter gemäß der Ethikkommission ein und erklären Sie der Mutter alles, was getan wird, und gehen Sie auf alle Zweifel, Bedenken, Ängste und Ängste bezüglich des Eingriffs ein, um die Mutter entspannt zu halten.
2. Lassen Sie die Mutter Milch mit einer elektrischen Milchpumpe in einen sterilisierten Behälter abpressen, unter Aufsicht der für die Station verantwortlichen Krankenschwester, wobei die festgelegten lokalen Hygienestandards jeder Entbindungsstation eingehalten werden.
3. Beschriften Sie nach der Entnahme den Behälter mit der Milch mit den Informationen der Mutter, dem Datum und der Uhrzeit der Entnahme. Halten Sie die Muttermilch (MOM) bis zu 12 h bei einer Temperatur von -4 °C oder niedriger.

2. Auftauen von pasteurisierter Spendermilch (PDM)

HINWEIS: Die HMBs verfügen über einen eigenen PDM-Vorrat, der für einen Zeitraum von maximal 6 Monaten bei einer Temperatur unter -4 °C eingefroren wird, und das Verfahren ist in der Literatur an anderer Stelle gut beschrieben 12,13,14.

1. Tauen Sie Rohmilch oder PDM, die in sterilisierten Glasbehältern mit Kunststoffdeckel gelagert werden, in einem Wasserbad bei 40 °C auf, um eine Temperaturerhaltung und eine kürzere Verarbeitungszeit zu gewährleisten.
   HINWEIS: Tauen Sie PDM nicht bei Raumtemperatur oder Kühltemperatur (im Kühlschrank) auf, da die Auftauzeiten in diesen Fällen verlängert werden, was die mikrobielle Exposition und das Wachstum fördert.
2. Nehmen Sie die Muttermilchflaschen aus dem Wasserbad, bevor die Milch in der Flasche eine Temperatur von über 5 °C erreicht.

3. Inokulation von PDM mit MOM zur Rekonstitution des Mikrobioms

HINWEIS: Das Standard-Volumenverhältnis für den Prozess der Inokulation von PDM mit MOM beträgt 90%: 10% (v/v). Die Schritte des Verfahrens sind wie folgt:

1. Weisen Sie den Techniker an, einen Laborkittel, eine Maske, eine Mütze und Handschuhe zu tragen.
2. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit einer Oberflächenreinigungslösung gemäß dem lokalen institutionellen Protokoll.
3. Ordnen Sie die zu verwendenden Materialien an und bereiten Sie die Ausrüstung vor. Den Inkubator (Wasserbad) mit Wasser auf 37 °C vorheizen.
4. Planen Sie die endgültige Menge der zu verwendenden geimpften Milch und wählen Sie einen Behälter in geeigneter Größe. Stellen Sie den Behälter mit frischem rohem MOM und dem PDM in flüssiger Form auf die Arbeitsfläche.
5. Entnehmen Sie ein Aliquot von bis zu 1 ml des MOM mit sterilen Geräten für die anschließende 16S-Sequenzierung und Bakterienzählung. Lagern Sie das Aliquot in einem DNase/RNase-freien Kryoröhrchen bei -80 °C.
6. Das verbleibende Volumen, das 10 % des gewünschten Milchvolumens entspricht, wird mit einem sterilen volumetrischen Instrument (z. B. Spritze, Pipette) in ein lebensmittelechtes Gefäß umgefüllt und in ein Wasserbad bei 37 °C getaucht.
7. Entnehmen Sie ein 1 ml-Aliquot des PDM mit sterilen Geräten für die anschließende 16S-Sequenzierung und Bakterienzählung. Lagern Sie das Aliquot in einem DNase/RNase-freien Kryoröhrchen bei -80 °C.
8. Übertragen Sie eine PDM-Menge, die 90 % des endgültigen gewünschten Milchvolumens entspricht, mit einem sterilen volumetrischen Instrument (z. B. Spritze, Pipette) in den Behälter mit der MOM aus dem vorherigen Schritt, die nun die inokulierte Muttermilch (IM) bildet.
9. Verschließen Sie den Behälter mit einem Deckel, der verhindert, dass externe Flüssigkeiten das Innere der Flasche verunreinigen, und tauchen Sie ihn 4 h lang bei 37 °C in das Wasserbad, damit sich die in der Milch inokulierten Mikroorganismen vermehren können.
10. Nach 4 h nehmen Sie das Gefäß mit der fermentierten IM aus dem Wasserbad, das jetzt als rekonstituierte Milch (RM) bezeichnet wird.
11. Reservieren Sie ein Aliquot von bis zu 1 ml mit sterilen Geräten für die nachfolgende 16S-Sequenzierung und Bakterienzählung. Lagern Sie das Aliquot in einem DNase/RNase-freien Kryoröhrchen bei -80 °C.
12. Übertragen Sie das verbleibende Volumen in einen desinfizierten Behälter zum Füttern von Neugeborenen.

4. Validierung der Methode durch Bakterienkultivierung auf Platten

HINWEIS: Alle Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Kontamination zu verhindern und die Genauigkeit der Verdünnungen zu gewährleisten. Das Bakterienwachstum kann mit den an anderer Stelle beschriebenen Methoden abgeschätzt werden ^9,15.

1. Bereiten Sie serielle Verdünnungen jeder Milchprobe (PDM, MOM, IM, RM) in steriler Kochsalzlösung in den Konzentrationen ^10-1, ^10-2, ^10-3 und ^10-4 vor. Mischen Sie jede Verdünnung gründlich, um eine gleichmäßige Bakterienverteilung zu gewährleisten.
2. 100 μl jeder verdünnten Probe pipetieren und mit einer sterilen Drigalski-Schlaufe oder einem Glasstreuer in dreifacher Ausfertigung auf Man-Rogosa-Sharpe (MRS)- und Mannitol-Salz-Agar (MSA)-Platten verteilen. Achten Sie darauf, dass das Volumen gleichmäßig auf der Agarplatte verteilt ist.
3. Inkubieren Sie MRS-Agarplatten in einem anaeroben Gefäß, das eine sauerstoffarme Umgebung für das Wachstum von Milchsäurebakterien schafft.
4. Inkubieren Sie Mannitol-Salz-Agar (MSA)-Platten aerob, um das Wachstum von Staphylokokken-Arten zu unterstützen.
5. Die Platten bei 37 ± 2 °C 48-72 h inkubieren.
6. Wählen Sie die Verdünnung mit einer zählbaren Anzahl von Bakterienkolonien (25-250 Kolonien) auf jeder Art von Agar
7. Zählen Sie die sichtbaren Kolonien auf jeder der drei Replikationsplatten für die ausgewählte Verdünnung.
8. Berechnen Sie die durchschnittliche Koloniezahl aus dreifachen Platten für die ausgewählte Verdünnung in MRS- und MSA-Medien.
9. Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro ml für jede Probe mit der folgenden Formel und konvertieren Sie sie in eine logarithmische Skala zur Basis 10 (log10), um die Interpretation zu erleichtern. Fahren Sie mit der statistischen Analyse der Ergebnisse fort.
   Anzahl der KBE/ml = Anzahl der Kolonien × Gesamtverdünnungsfaktor/plattiertes Volumen in mL

5. Analyse des Milchmikrobioms

HINWEIS: Die Milchmikrobiomanalyse kann gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Methoden und der Pipeline durchgeführt werden¹⁶. Ein Screenshot des R-Skripts, das in dieser Analyse verwendet wird, ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

1. 500 μl der Probe für 15 s bei 180 × g zentrifugieren, um Zellen und Partikel zu sedimentieren.
2. Sammeln Sie 350 μl des Überstands und verwenden Sie ihn für die DNA-Extraktion.
3. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA mit einem Spektralphotometer.
4. Amplifizieren Sie die V3- und V4-Regionen der ribosomalen 16S-RNA mit 20 ng DNA und den Primern 357F/805R (siehe Materialtabelle)¹⁷.
5. Verwenden Sie magnetische Kügelchen, um die resultierenden Amplikons zu reinigen, und quantifizieren Sie Barcode-Amplikons mit einem DNA-Fluorimeter.
6. Sequenzieren Sie die Amplikons im Paired-End-Modus mit 250 bp.
7. Die resultierenden Sequenzen werden durch Qualitätstrimmen und Entfernen des Adapters¹⁸ verarbeitet. Verwenden Sie den Paired-End-Modus (PE) mit Phred33-Scoring und legen Sie eine Mindestleselänge von 200 bp fest, um qualitativ hochwertige Lesevorgänge zu gewährleisten.
8. Importieren Sie Sequenzdaten mit gepaarten Enden in QIIME 2¹⁹ mit einem Manifest-Dateiformat und dem Befehl: qiime tools import.
9. Verarbeiten Sie die importierten Sequenzen mit DADA2 zur Entrauschung, Dereplikation und Chimärenentfernung mit dem Befehl: qiime dada2 denoise-paired. In diesem Schritt werden qualitativ hochwertige repräsentative Sequenzen und eine Feature-Tabelle generiert.
10. Filtern Sie Features und Sequenzen, um nur die Features und Sequenzen beizubehalten, die ausreichend repräsentiert sind, indem Sie die folgenden Befehle verwenden: qiime feature-table filter-features und qiime feature-table filter-seqs.
11. Bereiten Sie eine Referenzdatenbank vor, indem Sie Regionen extrahieren, die durch die Primer (V3-V4) amplifiziert wurden, indem Sie qiime feature-classifier extract-reads verwenden.
12. Verwenden Sie den VSEARCH-Algorithmus für die taxonomische Klassifizierung mit der Silva-Referenzdatenbank bei einem Identitätsschwellenwert von 97 %, indem Sie den folgenden Befehl ausführen:
    qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch
13. Integrieren Sie taxonomische Zuweisungen mit der Feature-Tabelle mithilfe von BIOM-Tools: biom add-metadata.
14. Führen Sie statistische Analysen durch, wie an anderer Stelle beschrieben^20,21.

Ergebnisse

Analyse des Bakterienwachstums durch Plattenkultivierung
Die mikrobiologischen Tests, die zur Validierung der Methode zur Inokulation von PDM mit dem MOM durchgeführt wurden, wie von Cacho et ^al.9 vorgeschlagen, zeigten, dass es auf der Grundlage der KBE/ml-Zahl keine signifikanten Unterschiede zwischen den inokulierten Milchproben vor und nach der 4-stündigen Inkubation gab. Zu diesen beiden Zeitpunkten wurden jedoch Unterschiede in der Anza...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in Entbindungskliniken angewendet werden soll, die mit einer Muttermilchbank verbunden sind, mit dem Ziel, PDM die Rekonstitution der Milchmikrobiota einer bestimmten Mutter zu ermöglichen, die aus verschiedenen Gründen ihrem Neugeborenen nicht genügend Milch zur Verfügung stellen kann. Das Protokoll ist einfach und basiert im Wesentlichen auf zwei Schritten. Die erste betrifft die Anwendung von Verfahren, die routinemäßig in Muttermilchbanke...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC