Индивидуализированное восстановление микробиоты грудного молока человека: возможный подход в реальных условиях

Резюме

В статье описан протокол восстановления микробиоты пастеризованного донорского молока с использованием микробиоты собственного молока матери в практических, реальных условиях. Он демонстрирует эффективный рост бактерий и модуляцию микробиома, поддерживая целесообразное применение этой процедуры в рамках рутинного ухода за родильным домом и связанного с ним банка грудного молока.

Аннотация

Собственное материнское молоко (MOM) является наиболее полноценным пищевым ресурсом для новорожденных. В тех случаях, когда матери не могут вырабатывать достаточное количество молока или не могут кормить грудью, предпочтительной альтернативой является пастеризованное донорское грудное молоко (ПДМ), которое обычно предоставляется банками грудного молока. PDM предлагает превосходный спектр питательных и иммунологических элементов по сравнению с любой коммерчески доступной формулой. Однако для обеспечения биобезопасности PDM подвергается пастеризации — процессу, который инактивирует комменсальную микробиоту и снижает количество некоторых биологически активных соединений. В этом исследовании представлен протокол, разработанный для восстановления микробиоты ПДМ с использованием МОМ в качестве микробного источника, адаптируя подход к реальным клиническим условиям.

Протокол был внедрен в клиническое исследование, проведенное в родильном доме и связанном с ним банке грудного молока, с целью обеспечения персонализированным донорским молоком недоношенных детей, чьи матери не могут вырабатывать достаточное количество молока. Методология включает в себя инокуляцию PDM 10% MOM с последующей инкубацией при 37 °C в течение 4 ч. Микробиологический анализ продемонстрировал успешный рост бактерий в инокулированном молоке (ВМ) после инкубации, при этом профиль микробиоты восстановленного молока (РМ) очень похож на профиль МОМ, что указывает на эффективное восстановление микробиоты. Эти результаты свидетельствуют о том, что протокол восстановления осуществим для внедрения в неонатальную помощь с потенциалом для улучшения питательных и иммунологических качеств PDM, тем самым поддерживая здоровье и развитие новорожденных, не находящихся на грудном вскармливании.

Введение

Грудное молоко широко признано лучшим источником питания для новорожденных, обеспечивая не только необходимыми макро- и микроэлементами, но и сложным набором элементов, включая различные метаболиты и компоненты иммунной системы, такие как антитела, цитокины^{и клетки.} Кроме того, полезные свойства в грудном молоке также обусловлены сообществом комменсальных микроорганизмов. Все эти элементы грудного молока играют важнейшую роль в развитии новорожденного¹. На сообщество микроорганизмов, известное как микробиота, влияет сочетание таких факторов, как диета, образ жизни матери, тип родов и гестационный возраст, в результате чего каждое молоко имеет микробиоту с определенными характеристиками². Механизмы, с помощью которых микробиота грудного молока способствует неонатальному развитию, варьируются от защиты кишечной поверхности путем колонизации комменсальными бактериями до содействия созреванию иммунной системы за счет выработки метаболитов, которые взаимодействуют с иммунными клетками в кишечнике³. По этой причине индивидуализированный профиль микроорганизмов в молоке каждой матери делает его формой персонализированной медицины для новорожденных⁴.

Наличие здоровой микробиоты может помочь защитить новорожденного от колонизации потенциально патогенными микроорганизмами, занимая экологическую нишу и поддерживая питание, особенно для недоношенных детей, которые более уязвимы к этим внешним воздействиям из-за нахождения в больничных условиях и незрелой иммунной системы. Более того, матери, которые рожают преждевременно, часто испытывают трудности с выработкой молока в достаточном количестве для своих новорожденных. Выработка молока, как правило, ниже, чем младше гестационный возраст⁵ лет. В этих случаях оптимальным вариантом кормления новорожденного является пастеризованное донорское молоко, предоставляемое банками грудного молока (ИСБ)⁶.

Бразилия обладает самой большой и обширной сетью ИСБ в мире⁷. Эта сеть собирает, готовит и распределяет более 160 000 литров пастеризованного донорского грудного молока (ПДМ) по всей стране бесплатно для родителей через национальную единую систему здравоохранения (Sistema Único de Saúde), управляемую Министерством здравоохранения⁷. Пастеризация имеет важное значение для обеспечения биобезопасности донорского молока, предназначенного для новорожденных. Этот процесс обычно проводится по методу Холдера, который предполагает погружение емкости с сырым донорским грудным молоком в водяную баню при температуре 62,5 °C на 30 мин ^6,8. Полученный PDM затем хранится в холодильнике до тех пор, пока он не будет готов к употреблению. Однако пастеризация снижает жизнеспособность комменсальной микробиоты молока и снижает биодоступность различных биологически активных компонентов. Это связано с тем, что процесс пастеризации стандартизирован для предотвращения передачи патогенных микроорганизмов новорожденному. В этом контексте в 2017 году Качо и его коллеги описали возможность восстановления комменсальной микробиоты собственного молока матери путем инокуляции ее в различных пропорциях в PDM⁹. Их результаты показали, что использование 10% концентрации собственного молока матери (MOM) является оптимальной концентрацией для поддержания исходного состава профиля микробиома MOM. Такой подход снижает риск чрезмерного роста определенных бактерий, которые, хотя и обычно комменсальны, могут стать вредными, если их непропорционально много в восстановленном молоке. В частности, в исследовании было отмечено, что разведение в соотношении 1:10 (10% MOM + 90% PDM), инкубированное в течение 4 часов, привело к хорошо сбалансированной бактериальной нагрузке — примерно 60% от той, которая обнаружена в неразбавленном MOM, что указывает на более безопасный и эффективный подход. Напротив, более высокие разведения, такие как 3:10, приводили к чрезмерному росту бактерий, что подчеркивает критическую необходимость контролируемых концентраций и условий для обеспечения безопасности.

В данной статье мы демонстрируем, что процедура восстановления микробиоты грудного молока при ПДМ может быть реализована в реальных ситуациях в рамках плановой медицинской помощи родильного дома и связанного с ним банка грудного молока.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот протокол был выполнен в рамках процедур клинического исследования, проведенного нашей исследовательской группой (Бразильский реестр клинических испытаний, ReBEC RBR-729kr8x), и получил одобрение Комитета по этике (процесс CAAE No 41063520.4.0 000.0121) и информированное согласие всех участников до рандомизации и коллетирования образцов.

Процедура восстановления микробиоты молока выполняется в три этапа:

1. Получение сырого материнского молока

ПРИМЕЧАНИЕ: С порядком получения молока можно ознакомиться в других разделах^10,11.

1. Перед процедурой получите информированное согласие матери в соответствии с этическим комитетом и обязательно объясните матери все, что будет сделано, обращаясь к любым сомнениям, опасениям, страхам и тревогам по поводу процедуры, чтобы мать могла расслабиться.
2. Попросите мать сцедить молоко с помощью электрического молокоотсоса в стерилизованный контейнер под наблюдением старшей медсестры отделения, соблюдая установленные местные гигиенические нормы каждого родильного отделения.
3. После сбора пометьте контейнер с молоком, указав информацию о матери, дату и время сбора. Хранить собственное молоко матери (MOM) при температуре -4 °C или ниже до 12 часов.

2. Размораживание пастеризованного донорского молока (ПДМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: ИСБ имеют свой собственный запас ПДМ, замороженный при температуре ниже -4 °C в течение максимального периода до 6 месяцев, и процедура хорошо описана в литературе в других местах 12,13,14.

1. Размораживают сырое молоко или ПДМ, хранящие в стерилизованных стеклянных контейнерах с пластиковыми крышками на водяной бане при температуре 40 °C, что обеспечивает поддержание температуры и сокращение времени обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не размораживайте PDM при комнатной температуре или при температуре охлаждения (внутри холодильника), так как время размораживания в этих случаях увеличивается, что способствует воздействию микроорганизмов и их росту.
2. Снимите бутылки с грудным молоком с водяной бани до того, как молоко в бутылке нагреется выше 5 °C.

3. Посев ПДМ с МОМ для восстановления микробиома

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное объемное соотношение для процесса инокуляции PDM MOM составляет 90%: 10% (v/v). Этапы процедуры заключаются в следующем:

1. Проинструктируйте лаборанта надеть лабораторный халат, маску, кепку и перчатки.
2. Очистите рабочую поверхность раствором для очистки поверхностей в соответствии с местным институциональным протоколом.
3. Расставьте материалы, которые будут использоваться, и подготовьте оборудование. Разогрейте инкубатор (водяную баню) водой до 37 °С.
4. Спланируйте окончательный объем используемого инокулированного молока и выберите контейнер подходящего размера. Поместите емкость со свежим сырьем MOM и PDM в жидком виде на рабочую поверхность.
5. Соберите аликвоту до 1 мл МОМ с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвоту в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
6. С помощью стерильного волюметрического инструмента (например, шприца, пипетки) переложите оставшийся объем, эквивалентный 10% от конечного желаемого объема молока, в контейнер, безопасный для пищевых продуктов, чтобы погрузить его в водяную баню при температуре 37 °C.
7. Соберите 1 мл аликвоты PDM с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвоту в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
8. С помощью стерильного волюметрического инструмента (например, шприца, пипетки) переложите количество PDM, эквивалентное 90% от конечного желаемого объема молока (например, шприца, пипетки) с предыдущего этапа, теперь формируя инокулированное материнское молоко (ВМ).
9. Закройте контейнер крышкой, которая предотвращает загрязнение внутренней части бутылки внешней жидкостью, и погрузите ее в водяную баню при температуре 37 °C на 4 часа, чтобы микроорганизмы, инокулированные в молоко, могли размножаться.
10. Через 4 ч снимите емкость с ферментированным ИМ с водяной бани, теперь называемой восстановленным молоком (РМ).
11. Резервируйте аликвоту до 1 мл с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвотный запас в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
12. Оставшийся объем переложите в продезинфицированный контейнер для кормления новорожденных.

4. Валидация метода путем бактериального культивирования на планшетах

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить точность разведений. Рост бактерий можно оценить с помощью методов, описанных в других разделах ^9,15.

1. Приготовьте серийные разведения каждого образца молока (PDM, MOM, IM, RM) в стерильном физиологическом растворе в концентрациях ^10-1, ^10-2, ^10-3 и ^10-4 . Тщательно перемешайте каждое разбавление, чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий.
2. Пиппет и распределите по 100 мкл каждого разведенного образца на планшеты Man-Rogosa-Sharpe (MRS) и Mannitol Salt Agar (MSA) в трех экземплярах с помощью стерильной петли Дригальского или стеклянного разбрасывателя. Следите за тем, чтобы объем равномерно распределился по агаровой пластине.
3. Инкубируйте агаровые планшеты MRS в анаэробную банку, содержащую для создания среды с низким содержанием кислорода для роста молочнокислых бактерий.
4. Инкубируйте пластины солевого агара маннита (MSA) аэробно, чтобы поддержать рост видов Staphylococcus.
5. Инкубируйте планшеты при температуре 37 ± 2 °C в течение 48-72 часов.
6. Выберите разведение с подсчетным количеством колоний бактерий (25-250 колоний) на каждом типе агара
7. Подсчитайте видимые колонии на каждой из трех пластин репликации для выбранного разведения.
8. Рассчитайте среднее количество колоний по тройным планшетам для выбранного разведения в средах MRS и MSA.
9. Определите количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл для каждого образца с помощью следующей формулы и преобразуйте в логарифмическую шкалу по основанию 10 (log10) для облегчения интерпретации. Приступаем к статистическому анализу результатов.
   Количество КОЕ/мл = Количество колоний × общем коэффициенте разбавления/объеме в мл

5. Анализ микробиома молока

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ микробиома молока может быть выполнен в соответствии с методами и конвейером, описанными в других^{разделах 16}. Скриншот скрипта R, используемого в этом анализе, представлен на дополнительном рисунке S1.

1. Центрифугируйте 500 мкл образца в течение 15 с при давлении 180 × g для осаждения клеток и твердых частиц.
2. Соберите 350 мкл надосадочной жидкости и используйте ее для экстракции ДНК.
3. Количественно оцените выделенную ДНК с помощью спектрофотометра.
4. Амплифицируйте участки V3 и V4 рибосомальной РНК 16S с использованием 20 нг ДНК и праймеров 357F/805R (см. Таблицу материалов)¹⁷.
5. Используйте магнитные шарики для очистки полученных ампликонов и количественного определения ампликонов со штрих-кодом с помощью флуориметра ДНК.
6. Секвенируйте ампликоны в режиме парного конца 250.о.
7. Обработайте полученные последовательности, выполнив качественную обрезку и снятие адаптера¹⁸. Используйте режим парного конца (PE) с оценкой Phred33 и установите минимальную длину чтения 200.о., чтобы обеспечить высокое качество чтения.
8. Импортируйте данные парных последовательностей в QIIME 2¹⁹ с помощью формата файла манифеста и команды: qiime tools import.
9. Обработайте импортированные последовательности с помощью DADA2 для шумоподавления, дерепликации и удаления химер с помощью команды: qiime dada2 denoise-paired. На этом шаге генерируются высококачественные репрезентативные последовательности и таблица признаков.
10. Фильтруйте признаки и последовательности, чтобы сохранить только те из них, которые имеют достаточное представление, с помощью команд: qiime feature-table filter-features и qiime feature-table filter-seqs.
11. Подготовьте ссылочную базу данных путем извлечения областей, усиленных праймерами (V3-V4) с помощью: qiime feature-classifier extract-reads.
12. Используйте алгоритм VSEARCH для таксономической классификации со ссылочной базой данных Silva при пороге идентичности 97%, выполнив команду:
    qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch
13. Интегрируйте таксономические присвоения с таблицей признаков с помощью инструментов BIOM: biom add-metadata.
14. Выполнение статистического анализа, как описано в других разделах^20,21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Анализ роста бактерий с помощью планшетного культивирования
Микробиологические тесты, проведенные для валидации метода инокуляции PDM MOM, предложенного Cacho et ^al.9, показали, что, исходя из количества КОЕ/мл, не было существенных различий между обр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол, который должен применяться в родильных домах, связанных с банком грудного молока, с целью обеспечить ПДМ восстановление микробиоты молока от конкретной матери, которая по разным причинам не может обеспечить достаточного количества мо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC