Reconstitution individualisée du microbiote du lait maternel : une approche réalisable dans des contextes réels

Résumé

L’article décrit un protocole de reconstitution du microbiote pasteurisé du lait maternel à l’aide du microbiote du lait de la mère dans des contextes pratiques et réels. Il démontre une croissance bactérienne et une modulation du microbiome efficaces, soutenant l’application réalisable de cette procédure dans les soins de routine d’une maternité et de sa banque de lait maternel associée.

Résumé

Le lait maternel est la ressource nutritionnelle la plus complète pour les nouveau-nés. Dans les cas où les mères ne sont pas en mesure de produire suffisamment de lait ou ne peuvent pas allaiter, l’alternative privilégiée est le lait maternel pasteurisé de donneuses (PDM), qui est régulièrement fourni par les banques de lait maternel. PDM offre une gamme supérieure d’éléments nutritionnels et immunologiques par rapport à toute formule disponible dans le commerce. Cependant, pour assurer la biosécurité, la PDM subit une pasteurisation, un processus qui inactive le microbiote commensal, et réduit certains composés bioactifs. Cette étude présente un protocole conçu pour restaurer le microbiote de la PDM en utilisant le MOM comme source microbienne, en adaptant l’approche à un cadre clinique réel.

Le protocole a été mis en œuvre dans le cadre d’un essai clinique mené dans une maternité et sa banque de lait maternel associée, dans le but de fournir du lait de donneuses personnalisé aux prématurés dont les mères ne peuvent pas produire suffisamment de lait. La méthodologie consiste à inoculer 10 % de MOM au PDM, suivi d’une incubation à 37 °C pendant 4 h. L’analyse microbiologique a démontré une croissance bactérienne réussie dans le lait inoculé (IM) après l’incubation, le profil du microbiote du lait reconstitué (MR) ressemblant étroitement à celui du MOM, indiquant une restauration efficace du microbiote. Ces résultats suggèrent que le protocole de reconstitution est réalisable pour une mise en œuvre dans les soins néonatals, avec le potentiel d’améliorer la qualité nutritionnelle et immunologique de la PDM, soutenant ainsi la santé et le développement des nouveau-nés non allaités.

Introduction

Le lait maternel est largement reconnu comme la meilleure source de nutrition pour les nouveau-nés, fournissant non seulement des macro et micronutriments essentiels, mais également un éventail complexe d’éléments, y compris divers métabolites et composants du système immunitaire, tels que les anticorps, les cytokines et les cellules¹. De plus, les propriétés bénéfiques du lait maternel proviennent également d’une communauté de micro-organismes commensal. Tous ces éléments du lait maternel jouent un rôle crucial dans le développement du nouveau-né¹. La communauté de micro-organismes, connue sous le nom de microbiote, est influencée par une combinaison de facteurs tels que l’alimentation, le mode de vie maternel, le type d’accouchement et l’âge gestationnel, ce qui fait que chaque lait possède un microbiote aux caractéristiques particulières². Les mécanismes par lesquels le microbiote du lait maternel favorise le développement néonatal vont de la protection de la surface entérique à la colonisation par des bactéries commensales à la promotion de la maturation du système immunitaire par la production de métabolites qui interagissent avec les cellules immunitaires de l’intestin³. Pour cette raison, le profil individualisé des micro-organismes dans le lait de chaque mère en fait une forme de médecine personnalisée pour les nouveau-nés⁴.

La présence d’un microbiote sain peut aider à protéger le nouveau-né contre la colonisation par des micro-organismes potentiellement pathogènes en occupant la niche écologique et en soutenant la nutrition, en particulier pour les nourrissons prématurés, qui sont plus vulnérables à ces impacts externes en raison de leur séjour en milieu hospitalier et de leur système immunitaire immature. De plus, les mères qui accouchent prématurément ont souvent des difficultés à produire du lait en quantité suffisante pour leurs nouveau-nés. La production de lait est généralement plus faible à mesure que l’âge gestationnel est jeune :⁵ ans. Dans ces cas, la meilleure option pour nourrir le nouveau-né est le lait de donneuse pasteurisé fourni par les banques de lait maternel (HMB)⁶.

Le Brésil possède le réseau de HMB le plus vaste et le plus étendu au monde⁷. Ce réseau collecte, prépare et distribue plus de 160 000 litres de lait maternel pasteurisé de donneuses (PDM) dans tout le pays, sans frais pour les parents, par le biais du système national de santé unifié (Sistema Único de Saúde), géré par le ministère de la Santé⁷. La pasteurisation est essentielle pour assurer la biosécurité du lait donné destiné aux nouveau-nés. Ce processus est généralement réalisé à l’aide de la méthode Holder, qui consiste à immerger un récipient de lait maternel cru de donneuse dans un bain-marie à 62,5 °C pendant 30 min ^6,8. Le PDM résultant est ensuite stocké sous réfrigération jusqu’à ce qu’il soit prêt à être consommé. Cependant, la pasteurisation réduit la viabilité du microbiote commensale du lait et diminue la biodisponibilité de divers composants bioactifs. En effet, le processus de pasteurisation est standardisé pour éviter la transmission de micro-organismes pathogènes au nouveau-né. Dans ce contexte, en 2017, Cacho et ses collègues ont décrit la possibilité de reconstituer le microbiote commensale du lait d’une mère en l’inoculant dans diverses proportions dans le PDM⁹. Leurs résultats ont démontré que l’utilisation d’une concentration de 10 % du lait maternel (MOM) est la concentration optimale pour maintenir la composition originale du profil microbiome MOM. Cette approche réduit le risque de prolifération de bactéries spécifiques, qui, bien que généralement commensales, pourraient devenir nocives si elles sont présentes de manière disproportionnée dans le lait reconstitué. Plus précisément, l’étude a observé qu’une dilution de 1:10 (10 % de MOM + 90 % de PDM), incubée pendant 4 h, entraînait une charge bactérienne bien équilibrée – environ 60 % de celle trouvée dans le MOM non dilué – indiquant une approche plus sûre et plus efficace. En revanche, des dilutions plus élevées, telles que 3:10, ont entraîné une croissance bactérienne excessive, soulignant la nécessité critique de concentrations et de conditions contrôlées pour garantir la sécurité.

Dans cet article, nous démontrons que cette procédure de reconstitution du microbiote du lait maternel dans la PDM peut être réalisée en situation réelle dans le cadre des soins courants d’une maternité et de sa banque de lait maternel associée.

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Protocole

Ce protocole a été réalisé dans le cadre des procédures d’un essai clinique mené par notre groupe de recherche (Registre brésilien des essais cliniques, ReBEC RBR-729kr8x), et a reçu l’approbation du Comité d’éthique (processus CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) et le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants avant la randomisation et la collecte de l’échantillon.

La procédure de reconstitution du microbiote laitier se fait en trois étapes :

1. Obtenir le lait cru de la mère

REMARQUE : La procédure d’obtention du lait peut être trouvée ailleurs^10,11.

1. Avant la procédure, obtenez le consentement éclairé de la mère selon le comité d’éthique et assurez-vous d’expliquer tout ce qui sera fait à la mère, en répondant à tous les doutes, préoccupations, craintes et angoisses concernant la procédure pour garder la mère détendue.
2. Faire exprimer le lait à l’aide d’un tire-lait électrique dans un récipient stérilisé sous la supervision de l’infirmière responsable de l’unité, en suivant les normes d’hygiène locales établies dans chaque maternité.
3. Après la collecte, étiquetez le récipient contenant le lait avec les informations de la mère, la date et l’heure de la collecte. Conservez le lait maternel à une température de -4 °C ou moins pendant 12 h maximum.

2. Décongélation du lait de donneuse pasteurisé (PDM)

REMARQUE : Les HMB ont leur propre stock de PDM, congelé à une température inférieure à -4 °C pendant une période maximale allant jusqu’à 6 mois, et la procédure est bien décrite dans la littérature ailleurs 12,13,14.

1. Décongelez le lait cru ou PDM stocké dans des récipients en verre stérilisés avec des couvercles en plastique dans un bain-marie à 40 °C, assurant le maintien de la température et un temps de traitement plus court.
   REMARQUE : Ne décongelez pas le PDM à température ambiante ou à la température de réfrigération (à l’intérieur du réfrigérateur), car les temps de décongélation dans ces cas sont prolongés, ce qui favorise l’exposition et la croissance microbiennes.
2. Retirez les bouteilles de lait humain du bain-marie avant que le lait dans la bouteille n’atteigne une température supérieure à 5 °C.

3. Inoculation de PDM avec MOM pour la reconstitution du microbiome

REMARQUE : Le rapport volumétrique standard pour le processus d’inoculation du PDM avec MOM est de 90 % : 10 % (v/v). Les étapes de la procédure sont les suivantes :

1. Demandez au technicien de porter une blouse de laboratoire, un masque, une casquette et des gants.
2. Nettoyez la surface de travail avec une solution de nettoyage de surface conformément au protocole institutionnel local.
3. Disposer le matériel à utiliser et préparer l’équipement. Préchauffez l’incubateur (bain-marie) avec de l’eau à 37 °C.
4. Planifiez le volume final de lait inoculé à utiliser et choisissez un contenant de taille appropriée. Placez le récipient avec du MOM cru frais et le PDM sous forme liquide sur le plan de travail.
5. Prélever une aliquote d’au plus 1 mL de MOM à l’aide d’un équipement stérile pour le séquençage subséquent du 16S et le dénombrement des bactéries. Conservez l’aliquote dans un cryotube exempt de DNase/RNase à -80 °C.
6. Transférez le volume restant, équivalent à 10 % du volume final souhaité de lait, à l’aide d’un instrument volumétrique stérile (par exemple, seringue, pipette) dans un récipient sans danger pour les aliments à immerger dans un bain-marie à 37 °C.
7. Prélever une aliquote de 1 mL de PDM à l’aide d’un équipement stérile pour le séquençage ultérieur du 16S et le dénombrement bactérien. Conservez l’aliquote dans un cryotube exempt de DNase/RNase à -80 °C.
8. Transférez une quantité de PDM équivalente à 90 % du volume final souhaité de lait à l’aide d’un instrument volumétrique stérile (p. ex., seringue, pipette) dans le récipient contenant le MOM de l’étape précédente, formant maintenant le lait maternel inoculé (IM).
9. Fermez le récipient avec un couvercle qui empêche tout liquide extérieur de contaminer l’intérieur de la bouteille et plongez-le dans le bain-marie à 37 °C pendant 4 h pour permettre aux micro-organismes inoculés dans le lait de se multiplier.
10. Après 4 h, retirez le récipient contenant l’IM fermenté du bain-marie, maintenant appelé lait reconstitué (MR).
11. Réserver une aliquote d’au plus 1 mL à l’aide d’un équipement stérile pour le séquençage ultérieur du 16S et le dénombrement bactérien. Stockez la mémoire aliquote dans un cryotube exempt de DNase/RNase à -80 °C.
12. Transférez le volume restant dans un récipient aseptisé pour l’alimentation des nouveau-nés.

4. Validation de la méthode par culture bactérienne sur plaques

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles pour éviter la contamination et assurer la précision des dilutions. La croissance bactérienne peut être estimée à l’aide des méthodes décrites ailleurs ^9,15.

1. Préparez des dilutions en série de chaque échantillon de lait (PDM, MOM, IM, RM) dans une solution saline stérile à des concentrations de ^10-1, ^10-2, ^10-3 et ^10-4 . Mélangez soigneusement chaque dilution pour assurer une distribution bactérienne uniforme.
2. Pippete et étale 100 μL de chaque échantillon dilué sur des plaques de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) et de gélose au sel de mannitol (MSA) en trois exemplaires, à l’aide d’une boucle de Drigalski stérile ou d’un épandeur de verre. Assurez-vous que le volume est uniformément réparti sur la plaque de gélose.
3. Incuber des plaques de gélose MRS dans un bocal anaérobie contenant pour créer un environnement à faible teneur en oxygène pour la croissance des bactéries lactiques.
4. Incuber des plaques de gélose au sel de mannitol (MSA) en aérobie pour soutenir la croissance des espèces de staphylocoques.
5. Incuber les plaques à 37 ± 2 °C pendant 48 à 72 h.
6. Sélectionner la dilution avec un nombre dénombrable de colonies bactériennes (25-250 colonies) sur chaque type de gélose
7. Comptez les colonies visibles sur chacune des trois plaques répétées pour la dilution choisie.
8. Calculer le nombre moyen de colonies à partir de plaques triples pour la dilution sélectionnée dans les milieux MRS et MSA.
9. Déterminer le nombre d’unités formant colonies (UFC) par mL pour chaque échantillon à l’aide de la formule suivante et convertir en une échelle logarithmique en base 10 (log10) pour faciliter l’interprétation. Procéder à l’analyse statistique des résultats.
   Nombre d’UFC/mL = Nombre de colonies × facteur de dilution total/volume plaqué en mL

5. Analyse du microbiome du lait

REMARQUE : L’analyse du microbiome du lait peut être effectuée selon les méthodes et le pipeline décrits ailleurs¹⁶. Une capture d’écran du script R utilisé dans cette analyse est présentée dans la figure supplémentaire S1.

1. Centrifuger 500 μL de l’échantillon pendant 15 s à 180 × g pour les cellules de sédiments et les particules.
2. Prélever 350 μL de surnageant et l’utiliser pour l’extraction de l’ADN.
3. Quantifiez l’ADN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre.
4. Amplifier les régions V3 et V4 de l’ARN ribosomique 16S à l’aide de 20 ng d’ADN et d’amorces 357F/805R (voir le tableau des matériaux)¹⁷.
5. Utilisez des billes magnétiques pour purifier les amplicons résultants et quantifiez les amplicons à code-barres à l’aide d’un fluorimètre à ADN.
6. Séquencez les amplicons en mode 250 pb appariés.
7. Traitez les séquences résultantes en effectuant un découpage de qualité et en supprimant l’adaptateur¹⁸. Utilisez le mode d’extrémité appariée (PE) avec le score Phred33 et définissez une longueur de lecture minimale de 200 pb pour garantir des lectures de haute qualité.
8. Importez des données de séquence d’extrémité appariée dans QIIME 2¹⁹ à l’aide d’un format de fichier manifeste et de la commande : qiime tools import.
9. Traitez les séquences importées avec DADA2 pour le débruitage, la déréplication et l’élimination des chimères à l’aide de la commande : qiime dada2 denoise-paired. Cette étape génère des séquences représentatives de haute qualité et une table de caractéristiques.
10. Filtrez les caractéristiques et les séquences pour ne conserver que celles qui ont une représentation suffisante à l’aide des commandes : qiime feature-table filter-features et qiime feature-table filter-seqs.
11. Préparez une base de données de référence en extrayant les régions amplifiées par les amorces (V3-V4) à l’aide de : qiime feature-classifier extract-reads.
12. Utilisez l’algorithme VSEARCH pour la classification taxonomique avec la base de données de référence Silva à un seuil d’identité de 97 % en exécutant la commande :
    qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch
13. Intégrez les affectations taxonomiques à la table des fonctionnalités à l’aide des outils BIOM : biom add-metadata.
14. Effectuer les analyses statistiques décrites ailleurs^20,21.

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Résultats

Analyse de la croissance bactérienne par culture sur plaque
Les tests microbiologiques effectués pour valider la méthode d’inoculation de la PDM avec le MOM, telle que proposée par Cacho et ^al.9, ont démontré que, d’après la numération des UFC/mL, il n’y avait pas de différences significatives entre les échantillons de lait inoculé avant et après l’incubation de 4 heures. Cependant, des différences dans le nombre de colonie...

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Discussion

Nous présentons ici un protocole à appliquer dans les maternités associées à une banque de lait maternel, visant à fournir à la PDM la reconstitution du microbiote laitier d’une mère spécifique qui, pour diverses raisons, ne peut pas fournir suffisamment de lait à son nouveau-né. Le protocole est simple et repose essentiellement sur deux étapes. La première implique l’application de procédures couramment effectuées dans les banques de lait maternel pour la collecte cor...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electric breast milk pump	Horigen	XN-2219M2	Soft pump dual plus
Pyrex media bottles	Corning	CLS1395100	Glass containers with plastic lids
1000 µL pipette Labmate pro	Corning HTL SA	5666	Variable volume pipettor
Cryogenic vial	Corning	CLS431417	DNase/RNase-free 2 mL vials
15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	DNase/RNase-free 15 mL tubes
Water bath	EcoSonics	Q3.0/40A
Man–Rogosa–Sharpe (MRS)	Difco	288210	Lactic acid bacteria growth media
Mannitol Salt Agar (MSA)	Himedia	MH118	Staphylococcus  growth media
Anaerobic Jar	Permution		Create a low-oxygen environment for lactic acid bacteria growth
Extracta  Kit – DNA e RNA	Loccus	MPTA-PV16-B Y	DNA extraction Kit
Nanodrop	Promega	E6150	Quantus DNA
GoTaqG2	Promega	M7841	PCR amplication System
Quantus Fluorometer	Promega	E5150	DNA / RNA quantitation kit
MiSeq System	Illumina Inc.	M-GL-00006 v4.0	Sequencing equipment
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)	Illumina Inc.	MS-102-2002	Sequencing kits and reagents
Software name
Trimmomatic	http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic		Read trimming tool for Illumina NGS data
QIIME 2	https://docs.qiime2.org/2024.10/		Microbiome analysis package
Primer name	Primer sequence
16S_357F	TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG
16S_805R	GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC