Manejo de la gestación y la lactancia para conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente

Resumen

Este protocolo describe una técnica de manejo de la preñez y la alimentación para conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente, destinada a reducir la mortalidad de conejos recién nacidos y mejorar la eficiencia de la preparación de conejos editados genéticamente.

Resumen

Con el avance de la investigación científica, la demanda de modelos de conejos editados genéticamente está aumentando. Sin embargo, existen sistemas limitados de manejo de la preñez y la alimentación para conejos editados genéticamente, lo que lleva a bajas tasas de supervivencia entre los conejos editados genéticamente preparados por muchos investigadores inexpertos. Por lo tanto, es esencial una orientación adecuada. Este artículo resume las prácticas de preñez y alimentación de conejos genéticamente modificados desarrolladas en el laboratorio del autor y describe un conjunto de procesos fundamentales. Estos incluyen el diagnóstico de embarazo, la atención prenatal, la partería, la lactancia asistida, el destete y otros procedimientos, junto con el rescate y el cuidado de conejos recién nacidos débiles. En comparación con los métodos tradicionales de parto y crianza natural utilizados en las granjas de conejos, este enfoque implica un manejo más refinado, que requiere tiempo y esfuerzo adicionales, pero aumenta significativamente la tasa de supervivencia de los conejos lactantes. Los métodos descritos en este artículo son adecuados para la mayoría de los escenarios de cría en laboratorio que involucran conejos editados genéticamente o transferidos con embriones y proporcionan una referencia sencilla y efectiva para otros investigadores.

Introducción

Los conejos son un modelo animal clásico para la investigación biomédica y se están convirtiendo cada vez más en el modelo traslacional preferido para cerrar la brecha entre los modelos de roedores y los modelos de animales grandes ^1,2. En comparación con los animales grandes, los conejos tienen un tamaño corporal moderado, poco espacio para alimentarse, bajo costo de alimentación y una conveniente recolección de sangre, lo que favorece la recopilación repetida de datos de investigación y operaciones quirúrgicas. Los conejos se caracterizan por una buena capacidad reproductiva, un período de gestación corto (28-32 días para los conejos blancos de Nueva Zelanda), un gran número de nacimientos y un crecimiento rápido ^3,4. En comparación con los roedores, los conejos están más cerca de los humanos en filogénesis⁵. Es un sustituto experimental rentable y práctico de los cerdos y los primates no humanos⁶. En comparación con otros animales de edición genética de tamaño grande y mediano (cerdos, vacas, ovejas, gatos, perros, monos), el costo de preparación de los conejos de edición genética es bajo y el ciclo es corto. Con el desarrollo de la terapia génica ^7,8,9, la terapia con células madre 10,11,12,13, la investigación en ciencias del cerebro¹⁴ y otros campos científicos ^{1,15,16,17,18}, la demanda de especies no roedoras en la edición de genes está aumentando.

Los conejos de edición genética fueron considerados una vez como uno de los animales de edición genética de tamaño medio que podían realizar aplicaciones industriales⁶. Sin embargo, hasta hoy, los conejos editados genéticamente no han podido lograr una producción a gran escala. Una de las principales razones es que la producción y la cría de conejos con edición genética son un desafío, y la dificultad es mucho mayor que la de los ratones o ratas con edición genética. No hay muchos laboratorios que puedan cultivar conejos con edición genética de manera eficiente. A menudo es difícil para los principiantes preparar con éxito conejos de edición genética, y a menudo se encuentran con problemas desagradables como la baja tasa de embarazo¹⁹, el aborto²⁰, la distocia²¹, el rechazo de la lactancia por parte de las conejas²² y la muerte de las conejas lactantes²³. Sin embargo, hay pocos datos sistemáticos o guías bibliográficas sobre la gestación y la alimentación de conejos con edición genética o conejos transferidos con embriones. La mayoría de ellos se basan en la experiencia de las granjas de conejos comunes.

Por lo tanto, este artículo resume la experiencia madura del manejo de la gestación y la lactancia de conejos modificados genéticamente desde el laboratorio del autor, e introduce un conjunto de procesos básicos de conejos transferidos con embriones y conejos modificados genéticamente, incluido el diagnóstico de embarazo, atención prenatal, partería, alimentación asistida artificial, ablactación, así como el rescate y la lactancia de conejos bebés débiles. Este proceso está especialmente establecido para la cría de conejos con edición genética o conejos transferidos con embriones. En comparación con el método tradicional de parto y crianza natural de las granjas de conejos, el modelo de manejo del embarazo y la lactancia requiere más tiempo y energía, pero puede reducir en gran medida la mortalidad de los conejos bebés, y el esfuerzo vale la pena.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética para Experimentos con Animales del Centro de Animales de Laboratorio Médico de Guangdong. El número de revisión ética para la cría de conejos modificados genéticamente MKRN3 involucrada en este estudio es B202210-6. El estudio se adhiere a procedimientos de conformidad con las normas éticas descritas en la Declaración de Helsinki de 1975 (revisada en 1983). Los conejos de Nueva Zelanda utilizados en este estudio se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio Médico de Guangdong en China. El proceso de preñez y alimentación de conejos genéticamente modificados descrito en este artículo es un resumen de las prácticas diarias de cría de animales en el laboratorio del autor. Los detalles sobre los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diagnóstico del embarazo

1. Del^{12º al 14º} día después de la transferencia embrionaria (elija uno de los puntos de tiempo), confirme el embarazo a través de la palpación directa.
   NOTA: Este paso se puede omitir. Si la palpación es demasiado brusca y forzada, puede provocar un aborto espontáneo en conejas embarazadas.
   1. Sostenga la piel del cuello detrás de las orejas del conejo con una mano, deje que las nalgas del conejo se encojan hacia adelante, cerca de la cavidad abdominal de las nalgas del conejo, y luego use la otra mano para abrir la palma y palpar suavemente la parte posterior del abdomen.
   2. Presiona el abdomen hasta cierto punto. Si se palpa una cadena continua de bolas de carne lisas y elásticas, de tamaño similar a las habas, se considera embarazo²⁴.
2. Si las condiciones lo permiten, use ultrasonido a los 15^días después de la transferencia de embriones para determinar si la coneja está preñada. El diagnóstico de embarazo de los conejos se basa en la presencia de puntos ecogénicos pequeños y fuertes (sacos gestacionales) en la zona oscura líquida.
3. Durante el período de los 16^a 18^días después de la transferencia de embriones, observe al conejo dos veces al día por la mañana y por la noche, durante aproximadamente 15 minutos cada vez. Si se observa que la coneja exhibe comportamientos como inquietud, respiración rápida, arrancar el pelo para construir nidos, etc., durante el trabajo de parto o el celo, indica que la coneja está pseudoembarazada y no ha concebido realmente.
   NOTA: Si la transferencia de embriones falla, las conejas tendrán un pseudoembarazo similar al parto o al celo entre^{los días 16} y 18 debido a la disminución de la hormona lútea.

2. Atención prenatal

1. Permita que las conejas embarazadas coman libremente durante el embarazo y agregue alimento verde fresco una vez a la semana.
2. En la mañana o en la tarde^{del día} 25 después de la transferencia embrionaria, transfiera las conejas preñadas a la jaula de parto.
   1. Desinfecte la jaula de parto, la incubadora de animales, los restos de papel o las virutas con anticipación.
      NOTA: Elija una jaula de parto para conejos que cumpla con los criterios internacionales en tamaño. Asegúrese de que la jaula de parto tenga suficiente espacio para que la coneja madre se mueva. Elija una incubadora que pueda resistir el mordisco de la coneja madre. Elija trozos de papel gruesos con buena absorción de agua. De acuerdo con los requisitos y sugerencias de la administración local de instalaciones animales, seleccione los métodos de desinfección adecuados.
   2. Fije la incubadora en un lado de la jaula de parto y coloque toallas, virutas o trozos de papel en la incubadora de animales para que las conejas embarazadas hagan un nido.
   3. Proporcionar alimento y agua potable adecuados.
   4. Mueva suavemente las conejas preñadas a la jaula de parto.
   5. Preste atención a si las conejas embarazadas han hecho un nido en la incubadora todos los días. De lo contrario, agregue algunos restos de papel y toallas fuera de la incubadora en la mañana^{del día} 28 de embarazo.
      NOTA: Si las conejas embarazadas no anidan en la incubadora, es probable que no den a luz en la incubadora. Coloque algunas toallas y restos de papel fuera de la incubadora para evitar que los conejos recién nacidos pierdan temperatura y mueran fuera de la caja.

3. Parto

NOTA: El día 0 se refiere a poco después de la fertilización y la formación procariota. Los conejos son animales estimulantes de la ovulación que ovulan 10-12 horas después del apareamiento. Los embriones en estadio unicelular obtenidos al día siguiente del apareamiento se consideran en^{el día} 0,5. Si los embriones en estadio unicelular se cultivan in vitro durante solo 2-3 horas y luego se transfieren a conejos sustitutos, también se considera que es^{el día} 0,5 de embarazo.

1. Seguimiento prenatal
   NOTA: El período de gestación de los conejos es de 28 a 32 días. Si una coneja da a luz antes del^día 30 de embarazo, el tamaño del feto suele ser relativamente pequeño y hay casos raros de parto difícil. No es necesaria una intervención excesiva antes del^30º día.
   1. En la mañana del^día 30 de embarazo en conejos, realice la palpación abdominal para determinar aproximadamente el número, el tamaño y la actividad del feto.
      1. Sostenga la piel del cuello detrás de las orejas del conejo con una mano, deje que las nalgas del conejo se encojan hacia adelante, cerca de la cavidad abdominal de las nalgas del conejo, y luego use la otra mano para abrir la palma y palpar suavemente la parte posterior del abdomen. La fuerza debe ser ligera.
         NOTA: Al presionar el abdomen hasta cierto punto, se palparán varios elipsoides del tamaño de un huevo, que pueden sentir el movimiento del feto.
   2. Si se descubre que el número de fetos concebidos por conejas preñadas es sólo de 1-2,^{el día} 30 de la gestación, inyectar 0,02 mg de cloprostenol por vía intramuscular a las 17:00 horas para inducir el parto de las conejas al día siguiente.
      NOTA: Las conejas embarazadas tienen solo 1-2 fetos, que son propensos a la distocia o a la falla en el parto cuando maduran.
2. Apresura el parto
   NOTA: Si la coneja preñada no da a luz en la mañana^{del día} 31 de gestación, puede considerar si necesita acelerar el parto de acuerdo con las siguientes condiciones. Si hay más de 2 fetos, no se tomarán más medidas.
   1. Si la coneja embarazada solo está embarazada de 1-2 fetos y se le ha inyectado cloprostenol el día anterior, en la mañana^{del día} 31 de embarazo, inyecte 10 unidades de oxitocina en los músculos para inducir el parto.
   2. Si la coneja embarazada presenta signos de parto (como inquietud, respiración acelerada, dilatación vascular del oído, desplumar y hacer un nido, planificar el terreno, etc.), inyecte 10 unidades de oxitocina en los músculos para inducir el parto.
   3. Si la coneja embarazada no tiene signos de parto y el movimiento fetal es normal, continúe observando. Si no hay parto en la mañana del^día 32 de embarazo, inyecte 10 unidades de oxitocina en los músculos para inducir el parto.
      NOTA: Por lo general, el uso de oxitocina puede resolver el trabajo de parto difícil. Generalmente, 5-10 minutos después de la inyección de oxitocina, las conejas embarazadas comenzarán a dar a luz. La oxitocina es efectiva durante aproximadamente media hora y se puede administrar nuevamente después de media hora. No se recomienda inducir el parto con oxitocina más de 3 veces. Si la oxitocina no es eficaz, pídele a un veterinario que realice una cesárea. De lo contrario, el feto morirá en el útero, se ablandará y será expulsado de la vagina.

4. Obstetricia

1. Organice y prepare las incubadoras (Figura 1).
   NOTA: Prepárese con anticipación antes de que la coneja dé a luz. El tamaño de la incubadora utilizada en este estudio es de 45 cm × 30 cm × 15 cm de largo × ancho × alto.
   1. Agregue un acolchado absorbente estéril. Se recomiendan gránulos de mazorca de maíz.
   2. Extiende una toalla a modo de colchoneta cubierta con algodón artificial de plumón.
      NOTA: El material del algodón de plumón artificial es fibra de poliéster de grado infantil, que no es tóxica. El algodón de plumón artificial es muy adecuado para que los conejos recién nacidos se mantengan calientes. Sin embargo, no se puede usar para hacer un nido para la coneja madre, o se puede comer hasta el estómago.
2. Limpia rápidamente la mucosidad de los conejos recién nacidos con una toalla. Asegúrese de que respiren suavemente y luego colóquelos en la incubadora.
   NOTA: Si la respiración de los conejos recién nacidos se detiene, presione inmediatamente el tórax para la respiración auxiliar (25-35 veces/min) para reducir el diámetro del tórax en un 25%-30% hasta que se restablezca la respiración espontánea.
3. Después del parto de conejas preñadas, cuente el número de fetos nacidos. Pega tarjetas de información en la incubadora: genes modificados, número de conejos recién nacidos, fecha de nacimiento, etc.
   NOTA: La temperatura ambiente adecuada para los conejos recién nacidos es de 30-32 °C. Colocar una cantidad adecuada de pelo de conejo o algodón artificial dentro de la incubadora puede lograr un buen efecto de aislamiento. La casa de conejos debe mantenerse a 16-25 °C. Las conejas suelen tener entre 6 y 8 pezones. Si hay demasiados bebés, algunos bebés pueden ser alimentados por otras conejas madres.

5. Cuidados posparto

1. Cuidados de los conejos bebés (Figura 2)
   NOTA: Después de dar a luz, deje que la coneja madre descanse durante aproximadamente 1 h antes de amamantar. Los conejos suelen amamantar de 1 a 3 veces al día.
   1. Limpie todos los pezones de la coneja madre con alcohol, algodón antes de la primera alimentación. Excepto para amamantar, mantenga a las conejas madres y a las conejas bebés separadas en otros momentos.
   2. Masajea suavemente cada pezón y exprime suavemente la primera gota de leche.
   3. Alimentación de conejos bebés de 1-2 días de edad: Cada vez, coloque a la coneja madre en la colchoneta en posición lateral o prona y coloque a los conejos lactantes uno por uno en sus pezones para succionar la leche (Figura 2A). Los conejos de 1-2 días necesitan ser alimentados 2-3 veces al día.
      NOTA: Los conejos prematuros o los conejos bebés de bajo peso al nacer son propensos a la hipoglucemia. Alimente con 1 mL de glucosa al 5% y consuma leche materna lo antes posible. Si el conejo bebé está demasiado débil para beber, inyecte directamente 1 ml de glucosa al 5% en la cavidad abdominal.
   4. El segundo día después del nacimiento, use un rotulador para numerar el lomo de cada conejo bebé. Recorta una pequeña cantidad de tejido de la cola para el genotipado.
   5. Alimentación de conejos bebés de más de 2 días de edad: Al alimentarlo, coloque a la coneja madre en una incubadora y déjela amamantar por sí sola (Figura 2B). Los conejos de 2 a 9 días deben alimentarse 1 o 2 veces al día, y los conejos de más de 9 días deben alimentarse una vez al día hasta el destete. Asegúrese de que los conejos bebés estén llenos (Figura 2C).
      NOTA: Si la coneja madre no está dispuesta a amamantar, se le puede alimentar con algunas verduras frescas para que esté más dispuesta a cooperar. Si es necesario, las conejas madres pueden ser amamantadas después de ser colocadas en una posición estable. Exprima suavemente la primera gota de leche de cada pezón de la coneja madre para aliviar la hinchazón y el dolor de los senos, lo cual es beneficioso para que las conejas bebés mamen de la leche. Si los métodos anteriores no son efectivos, se deben usar otras conejas madres lactantes para amamantar.
   6. Durante los primeros 4 días después del nacimiento, limpie el perineo del conejo bebé dos veces al día con bolas de algodón húmedas para estimular la excreción de meconio y orina (Figura 2D).
   7. A medida que crezca el pelo del conejo bebé, retira un poco de algodón de la incubadora todos los días.
   8. Cambia la toalla una vez al día hasta que el conejito crezca hasta el punto en que todo su cuerpo esté cubierto de pelo.
      NOTA: Generalmente, la toalla ya no es necesaria a los 8^días después del parto.
   9. Si los conejos bebés (de 1 a 2 semanas de edad) experimentan diarrea, aliméntelos inmediatamente con 3 gotas de gentamicina de grado animal (la concentración es de 0,04 g/mL) dos veces al día durante 5 días consecutivos.
      NOTA: La diarrea en conejos bebés generalmente es causada por la succión de leche de conejas madres con mastitis, o por la alta temperatura y humedad del ambiente. La tasa de mortalidad de conejos bebés con diarrea es muy alta.
   10. Después de que el conejo joven abra los ojos (aproximadamente a las 2 semanas de edad), llévelo a una jaula de lactancia con una toalla. Agregue un poco de alimento verde y dieta diaria.
       NOTA: La temperatura adecuada para los conejos bebés (2-3 semanas de edad) es de 23-30 °C.
   11. Separe la coneja madre de las conejas bebés y abra el deflector solo una vez al día para amamantar.
       NOTA: Esto puede evitar que los conejos bebés muerdan el pezón de la coneja madre.
2. Cuidados postparto de la coneja madre
   1. Durante la lactancia, permita que las conejas madres beban y coman libremente y aliméntelas con alimento verde adecuado para garantizar una nutrición adecuada.
   2. Si la coneja madre sufre de mastitis, suspenda la lactancia materna inmediatamente y administre antibióticos veterinarios adecuados para el tratamiento (se recomiendan cefalosporinas). Alimenta a los conejos jóvenes con otras conejas madres lactantes con tiempos de parto similares.

6. Ablactación

1. Asegúrese de que la mayoría de los conejos jóvenes sean destetados a los 35 días de edad. Los conejos débiles se destetan a los 40 días de edad.
   NOTA: La temperatura adecuada para los conejos jóvenes (de 3 semanas a 3 meses de edad) es de 20-25 °C. La temperatura adecuada para conejos jóvenes (3-6 meses de edad) y conejos adultos también es de 15-25 °C.
2. Considerar la posibilidad de vacunar las vacunas convencionales de acuerdo con los requisitos experimentales después del destete.

Resultados

Este artículo describe un procedimiento de manejo de preñez y alimentación para conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente. A finales de 2022, el laboratorio del autor inició el desarrollo de una plataforma de preparación para conejos modificados genéticamente. Durante este período, se encontraron varios problemas comunes, como el aborto, la falta de parto a término, la distocia, la falta de arranque de pelo para la preparación del nido antes del parto, la f...

Discusión

Los principales pasos en el manejo de la gestación y la lactancia de conejos transferidos con embriones y modificados genéticamente incluyen la partería y la lactancia materna asistida temprana. El parto difícil es un problema común en los conejos¹⁹. Los partos prolongados a menudo resultan en isquemia fetal, hipoxia y muerte²⁵. El uso adecuado de la oxitocina puede acortar eficazmente los tiempos de parto y reducir los casos de distoc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290