Embriyo Transferi Yapılan ve Genetiği Değiştirilmiş Tavşanlarda Gebelik ve Hemşirelik Yönetimi

Özet

Bu protokol, embriyo transferli ve genetiği değiştirilmiş tavşanlar için yenidoğan tavşan ölümlerini azaltmayı ve gen düzenlemeli tavşanların hazırlama verimliliğini artırmayı amaçlayan bir hamilelik ve besleme yönetimi tekniğini tanımlar.

Özet

Bilimsel araştırmaların ilerlemesiyle birlikte, gen düzenlemeli tavşan modellerine olan talep artıyor. Bununla birlikte, gen düzenlemeli tavşanlar için sınırlı gebelik ve beslenme yönetim sistemleri vardır ve bu da birçok deneyimsiz araştırmacı tarafından hazırlanan gen düzenlemeli tavşanlar arasında düşük hayatta kalma oranlarına yol açmaktadır. Bu nedenle, doğru rehberlik şarttır. Bu makale, yazarın laboratuvarında geliştirilen genetiği değiştirilmiş tavşanlar için hamilelik ve beslenme uygulamalarını özetlemekte ve bir dizi temel süreci özetlemektedir. Bunlar arasında hamilelik teşhisi, doğum öncesi bakım, ebelik, yardımlı emzirme, sütten kesme ve diğer prosedürlerin yanı sıra zayıf yenidoğan tavşanların kurtarılması ve bakımı yer alır. Tavşan çiftliklerinde kullanılan geleneksel doğal doğum ve yetiştirme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım daha rafine yönetimi içerir, ek zaman ve çaba gerektirir, ancak emziren tavşanların hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırır. Bu makalede açıklanan yöntemler, gen düzenlenmiş veya embriyo transfer edilmiş tavşanları içeren çoğu laboratuvar ıslah senaryosu için uygundur ve diğer araştırmacılar için basit ve etkili bir referans sağlar.

Giriş

Tavşanlar, biyomedikal araştırmalar için klasik bir hayvan modelidir ve kemirgen modelleri ile büyük hayvan modelleri arasındaki boşluğu doldurmak için giderek daha fazla tercih edilen translasyonel model haline gelmektedir ^1,2. Büyük hayvanlarla karşılaştırıldığında, tavşanlar orta vücut büyüklüğüne, küçük beslenme alanına, düşük besleme maliyetine ve uygun kan alımına sahiptir, bu da araştırma verilerinin ve cerrahi operasyonların tekrar tekrar toplanmasına elverişlidir. Tavşanlar iyi üreme kabiliyeti, kısa bir gebelik süresi (Yeni Zelanda beyaz tavşanları için 28-32 gün), çok sayıda doğum ve hızlı büyüme^ile karakterizedir ^3,4. Kemirgenlerle karşılaştırıldığında, tavşanlar filogenez^5'te insanlara daha yakındır. Domuzlar ve insan olmayan primatlar için uygun maliyetli ve pratik bir deneysel alternatiftir⁶. Diğer büyük ve orta büyüklükteki gen düzenleme hayvanlarıyla (domuzlar, sığırlar, koyunlar, kediler, köpekler, maymunlar) karşılaştırıldığında, gen düzenleme tavşanlarının hazırlık maliyeti düşüktür ve döngü kısadır. Gen terapisi ^7,8,9, kök hücre tedavisi^10,11,12,13, beyin bilimi araştırmaları 14 ve diğer bilimsel alanların 1,15,16,17,18 gelişmesiyle birlikte, gen düzenlemede kemirgen olmayan türlere olan talep artmaktadır.

Gen düzenleme tavşanları, bir zamanlar endüstriyel uygulamaları gerçekleştirebilen orta büyüklükteki gen düzenleme hayvanlarından biri olarak kabul edilirdi⁶. Bununla birlikte, bugüne kadar, gen düzenleme tavşanları büyük ölçekli üretim elde edememiştir. Bunun ana nedenlerinden biri, gen düzenleyici tavşanların üretimi ve üremesinin zor olması ve zorluğun gen düzenleme yapan fareler veya sıçanlardan çok daha büyük olmasıdır. Gen düzenleme tavşanlarını verimli bir şekilde yetiştirebilecek çok fazla laboratuvar yoktur. Yeni başlayanlar için gen düzenleme tavşanlarını başarılı bir şekilde hazırlamak genellikle zordur ve genellikle düşük gebelik oranı¹⁹, kürtaj²⁰, distosi²¹, dişi tavşanlar²² tarafından laktasyonun reddedilmesi ve emziren tavşanların^{ölümü 23} gibi hoş olmayan problemlerle karşılaşırlar. Bununla birlikte, gen düzenleyici tavşanların veya embriyo transfer edilen tavşanların hamileliği ve beslenmesi hakkında az sayıda sistematik veri veya literatür kılavuzu vardır. Çoğu, sıradan tavşan çiftliklerinin deneyimlerine dayanmaktadır.

Bu nedenle, bu makale, yazarın laboratuvarından genetik olarak değiştirilmiş tavşanların olgun gebelik ve hemşirelik yönetimi deneyimini özetlemekte ve embriyo transferli tavşanların ve genetiği değiştirilmiş tavşanların gebelik teşhisi, doğum öncesi bakım, ebelik, yapay yardımlı beslenme, ablaktasyon ve zayıf yavru tavşanların kurtarılması ve emzirilmesi dahil olmak üzere bir dizi temel süreci tanıtmaktadır. Bu işlem, gen düzenleyici tavşanların veya embriyo transfer edilen tavşanların yetiştirilmesi için özel olarak kurulmuştur. Tavşan çiftliklerinin geleneksel doğal doğum ve yetiştirme yöntemiyle karşılaştırıldığında, hamilelik ve hemşirelik yönetimi modeli daha fazla zaman ve enerji gerektirir, ancak yavru tavşanların ölüm oranını büyük ölçüde azaltabilir ve çabaya değer.

Protokol

Tüm deney protokolleri, Guangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvanları Merkezi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada yer alan MKRN3 geni değiştirilmiş tavşan yetiştiriciliği için etik inceleme sayısı B202210-6'dır. Çalışma, 1975 tarihli Helsinki Deklarasyonu'nda (1983'te revize edilmiştir) belirtilen etik standartlara uygun prosedürlere bağlı kalmaktadır. Bu çalışmada kullanılan Yeni Zelanda tavşanları, Çin'deki Guangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nden elde edildi. Bu makalede anlatılan genetiği değiştirilmiş tavşanların hamilelik ve beslenme süreci, yazarın laboratuvarındaki günlük hayvan yetiştirme uygulamalarının bir özetidir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Gebelik teşhisi

1. Embriyo transferinden sonraki 12^{. ila} 14^{. günlerde (} zaman noktalarından birini seçin), doğrudan palpasyon yoluyla hamileliği onaylayın.
   NOT: Bu adım atlanabilir. Palpasyon çok sert ve kuvvetli ise, hamile tavşanlarda düşüklere neden olabilir.
   1. Boyun derisini bir elinizle tavşanın kulaklarının arkasında tutun, tavşanın kalçalarının karın boşluğuna yakın bir şekilde tavşanın kalçalarının öne doğru küçülmesine izin verin ve ardından diğer elinizi avuç içi açmak ve karnın arka ucunu nazikçe palpe etmek için kullanın.
   2. Karnı belli bir dereceye kadar bastırın. Baklaya büyüklüğüne benzer şekilde sürekli bir düz ve elastik et yumağı dizisi palpe edilirse, hamilelik olarak kabul edilir²⁴.
2. Koşullar izin verirse, tavşanın hamile olup olmadığını belirlemek için embriyo transferinden sonraki 15^{. günde ultrason} kullanın. Tavşanların gebelik tanısı, sıvı karanlık bölgede küçük, güçlü ekojenik noktaların (gebelik keseleri) varlığına dayanır.
3. Embriyo transferinden sonraki 16^{. ve 18}. günler boyunca, tavşanı sabah ve akşam günde iki kez, her seferinde yaklaşık 15 dakika gözlemleyin. Tavşanın doğum veya kızgınlık sırasında huzursuzluk, hızlı nefes alma, yuva yapmak için tüy yolma vb. davranışlar sergilediği gözlemlenirse, dişi tavşanın yalancı gebe olduğunu ve gerçekten gebe kalmadığını gösterir.
   NOT: Embriyo transferi başarısız olursa, dişi tavşanlarda luteal hormonun azalmasına bağlı olarak 16^{. ve 18}. günlerde doğum veya kızgınlığa benzer yalancı gebelik olacaktır.

2. Doğum öncesi bakım

1. Hamile tavşanların hamilelik sırasında serbestçe yemek yemelerine izin verin ve haftada bir kez taze yeşil yem ekleyin.
2. Embriyo transferinden sonraki 25^{. günün} sabahı veya akşamı, hamile tavşanları doğum kafesine aktarın.
   1. Teslimat kafesini, hayvan kuluçka makinesini, kağıt artıklarını veya talaşları önceden dezenfekte edin.
      NOT: Boyut olarak uluslararası kriterleri karşılayan bir tavşan doğum kafesi seçin. Doğum kafesinin anne tavşanın hareket etmesi için yeterli alana sahip olduğundan emin olun. Anne tavşan ısırığına direnebilecek bir kuluçka makinesi seçin. İyi su emme özelliğine sahip kalın kağıt parçalarını seçin. Yerel hayvan tesisi yönetiminin gereksinimlerine ve önerilerine göre uygun dezenfeksiyon yöntemlerini seçin.
   2. Kuluçka makinesini doğum kafesinin bir tarafına sabitleyin ve hamile tavşanların yuva yapması için hayvan kuluçka makinesine havlu, talaş veya kağıt artıkları koyun.
   3. Yeterli yem ve içme suyu sağlayın.
   4. Hamile tavşanları yavaşça doğum kafesine taşıyın.
   5. Hamile tavşanların her gün kuluçka makinesinde yuva yapıp yapmadıklarına dikkat edin. Değilse, hamileliğin 28^{. gününün} sabahı kuvözün dışına biraz kağıt parçası ve havlu ekleyin.
      NOT: Hamile tavşanlar kuluçka makinesinde yuva yapmazsa, muhtemelen kuluçka makinesinde doğum yapmayacaktır. Yeni doğan tavşanların sıcaklık kaybetmesini ve kutunun dışında ölmesini önlemek için kuluçka makinesinin dışına biraz havlu ve kağıt parçaları koyun.

3. Doğum

NOT: 0. gün, döllenme ve prokaryotik oluşumdan kısa bir süre sonrasını ifade eder. Tavşanlar, çiftleşmeden 10-12 saat sonra yumurtlayan yumurtlamayı uyaran hayvanlardır. Çiftleşmeden sonraki gün elde edilen tek hücreli evre embriyoların 0.5^{. günde olduğu} kabul edilir. Tek hücreli evre embriyolar sadece 2-3 saat boyunca in vitro olarak kültürlenir ve daha sonra vekil tavşanlara aktarılırsa, aynı zamanda gebeliğin 0.5^{. günü olarak} kabul edilir.

1. Doğum öncesi izleme
   NOT: Tavşanların gebelik süresi 28-32 gündür. Bir tavşan hamileliğin 30^{. gününden} önce doğum yaparsa, fetüsün büyüklüğü genellikle nispeten küçüktür ve nadir görülen zor doğum vakaları vardır. 30^{. günden önce} aşırı bir müdahaleye gerek yoktur.
   1. Tavşanlarda gebeliğin 30^{. gününün} sabahı, fetüsün sayısını, boyutunu ve aktivitesini kabaca belirlemek için abdominal palpasyon yapın.
      1. Boyun derisini bir elinizle tavşanın kulaklarının arkasında tutun, tavşanın kalçalarının karın boşluğuna yakın bir şekilde tavşanın kalçalarının öne doğru küçülmesine izin verin ve ardından diğer elinizi avuç içi açmak ve karnın arka ucunu nazikçe palpe etmek için kullanın. Kuvvet hafif olmalı.
         NOT: Karın içine belirli bir dereceye kadar bastırmak, fetüsün hareketini hissedebilen birkaç yumurta büyüklüğünde elipsoidi palpe edecektir.
   2. Gebe tavşanlar tarafından gebe kalan fetüs sayısının sadece 1-2 olduğu tespit edilirse, gebeliğin 30^{. gününde} , tavşanların ertesi gün doğumunu sağlamak için saat 5'te kas içine 0.02 mg kloprostenol enjekte edin.
      NOT: Hamile tavşanların, olgunlaştığında distosiye veya doğum başarısızlığına eğilimli olan sadece 1-2 fetüsü vardır.
2. Doğumu hızlandırın
   NOT: Gebe tavşan gebeliğin 31^. gününün sabahında doğum yapmazsa, aşağıdaki koşullara göre doğumu hızlandırması gerekip gerekmediğini değerlendirebilir. 2'den fazla fetüs varsa, başka bir işlem yapılmayacaktır.
   1. Hamile tavşan sadece 1-2 fetüse hamileyse ve bir gün önce kloprostenol enjekte edilmişse, hamileliğin 31^{. gününün} sabahı, doğumu başlatmak için kaslara 10 ünite oksitosin enjekte edin.
   2. Gebe tavşanda doğum belirtileri varsa (huzursuzluk, hızlı nefes alma, kulak damar genişlemesi, yolma ve yuva yapma, zemini planlama vb.), doğumu başlatmak için kaslara 10 ünite oksitosin enjekte edin.
   3. Hamile tavşanda doğum belirtisi yoksa ve fetal hareket normalse, gözlemlemeye devam edin. Hamileliğin 32^{. gününün} sabahında doğum olmazsa, doğumu başlatmak için kaslara 10 ünite oksitosin enjekte edin.
      NOT: Genellikle, oksitosin kullanımı zor emeği çözebilir. Genellikle oksitosin enjeksiyonundan 5-10 dakika sonra hamile tavşanlar doğuma başlar. Oksitosin yaklaşık yarım saat etkilidir ve yarım saat sonra tekrar uygulanabilir. Oksitosin ile doğumun 3 defadan fazla başlatılması önerilmez. Oksitosin etkisiz ise, bir veterinere sezaryen yaptırın. Aksi takdirde fetüs rahim içinde ölür, yumuşar ve vajinadan atılır.

4. Ebelik

1. İnkübatörleri düzenleyin ve hazırlayın (Şekil 1).
   NOT: Tavşan doğum yapmadan önce önceden hazırlanın. Bu çalışmada kullanılan inkübatörün boyutu 45 cm × 30 cm × uzunluğu × genişliği × yüksekliğindedir.
   1. Steril emici dolgu ekleyin. Mısır koçanı granülleri tavsiye edilir.
   2. Suni kuş tüyü pamukla kaplı bir paspas olarak bir havlu yayın.
      NOT: Suni kuş tüyü pamuğun malzemesi, toksik olmayan bebek sınıfı polyester elyaftır. Suni kuş tüyü pamuk, yeni doğan tavşanların sıcak kalması için çok uygundur. Ancak anne tavşan için yuva yapmak için kullanılamaz veya mideye yenebilir.
2. Yenidoğan tavşanların üzerindeki mukusu bir havluyla hızlıca silin. Düzgün nefes aldıklarından emin olun ve ardından onları inkübatöre koyun.
   NOT: Yenidoğan tavşanların solunumu durursa, spontan solunum geri gelene kadar göğüs çapını %25-30 oranında azaltmak için yardımcı solunum için hemen göğsüne (25-35 kez/dk) bastırın.
3. Hamile tavşanların doğumundan sonra, doğan fetüslerin sayısını sayın. Kuluçka makinesine bilgi kartları yapıştırın: değiştirilmiş genler, yeni doğan tavşan sayısı, doğum tarihi vb.
   NOT: Yenidoğan tavşanlar için uygun ortam sıcaklığı 30-32 °C'dir. Kuluçka makinesinin içine uygun miktarda tavşan kılı veya suni kuş tüyü pamuk yerleştirmek iyi bir yalıtım etkisi sağlayabilir. Tavşan evi 16-25 °C'de muhafaza edilmelidir. Dişi tavşanların genellikle 6-8 meme ucu vardır. Çok fazla bebek varsa, bazı bebekler diğer anne tavşanlar tarafından beslenebilir.

5. Doğum sonrası bakım

1. Yavru tavşan bakımı (Şekil 2)
   NOT: Doğum yaptıktan sonra, anne tavşanı emzirmeden önce yaklaşık 1 saat dinlendirin. Tavşanlar genellikle günde 1-3 kez emzirirler.
   1. İlk beslemeden önce anne tavşanın tüm meme uçlarını alkollü pamukla temizleyin. Emzirme dışında diğer zamanlarda anne tavşanları ve yavru tavşanları ayrı ayrı besleyin.
   2. Her meme ucuna nazikçe masaj yapın ve sütün ilk damlasını nazikçe sıkın.
   3. 1-2 günlük yavru tavşanların beslenmesi: Her seferinde anne tavşanı yan pozisyonda veya yüzüstü pozisyonda matın üzerine yerleştirin ve süt emmek için emen tavşanları tek tek meme uçlarına yerleştirin (Şekil 2A). 1-2 günlük tavşanların günde 2-3 kez beslenmesi gerekir.
      NOT: Prematüre tavşanlar veya düşük doğum ağırlıklı bebek tavşanlar hipoglisemiye eğilimlidir. 1 mL% 5 glikoz ile besleyin ve mümkün olan en kısa sürede anne sütü tüketin. Yavru tavşan içemeyecek kadar zayıfsa, karın boşluğuna doğrudan 1 mL% 5 glikoz enjekte edin.
   4. Doğumdan sonraki ikinci günde, her yavru tavşanın sırtını numaralandırmak için bir keçeli kalem kullanın. Genotipleme için az miktarda kuyruk dokusunu kesin.
   5. 2 günlükten büyük yavru tavşanların beslenmesi: Beslerken anne tavşanı bir kuluçka makinesine koyun ve kendi kendine emzirmesine izin verin (Şekil 2B). 2-9 günlük tavşanların günde 1-2 kez, 9 günlük tavşanların ise sütten kesilene kadar günde bir kez beslenmesi gerekir. Yavru tavşanların dolu olduğundan emin olun (Şekil 2C).
      NOT: Anne tavşan emzirmek istemiyorsa, işbirliği yapmaya daha istekli hale getirmek için bazı taze sebzelerle beslenebilir. Gerekirse anne tavşanlar stabil pozisyona getirildikten sonra emzirilebilir. Göğüs şişmesini ve ağrısını hafifletmek için anne tavşanın her bir meme ucundan ilk damla sütü nazikçe sıkın, bu da yavru tavşanların sütü emmesi için faydalıdır. Yukarıdaki yöntemler etkisiz ise, emzirme için diğer emziren anne tavşanlar kullanılmalıdır.
   6. Doğumdan sonraki ilk 4 gün boyunca, mekonyum ve idrar atılımını uyarmak için yavru tavşanın perinesini günde iki kez ıslak pamuk toplarıyla temizleyin (Şekil 2D).
   7. Yavru tavşanın tüyleri büyüdükçe, her gün kuluçka makinesinden biraz pamuk çıkarın.
   8. Yavru tavşan tüm vücudunun tüylerle kaplı olduğu noktaya kadar büyüyene kadar havluyu günde bir kez değiştirin.
      NOT: Genellikle doğumdan sonraki 8^{. günde} havluya artık ihtiyaç duyulmaz.
   9. Bebek tavşanlar (1-2 haftalık) ishal yaşarsa, hemen art arda 5 gün boyunca günde iki kez 3 damla hayvansal sınıf gentamisin (konsantrasyon 0.04 g / mL'dir) ile besleyin.
      NOT: Yavru tavşanlarda ishal genellikle mastitisli anne tavşanlardan süt emilmesi veya ortamın yüksek sıcaklık ve neminden kaynaklanır. İshalli yavru tavşanların ölüm oranı çok yüksektir.
   10. Genç tavşan gözlerini açtıktan sonra (yaklaşık 2 haftalık), bir havluyla emzirme kafesine taşıyın. Biraz yeşil yem ve günlük diyet ekleyin.
       NOT: Yavru tavşanlar (2-3 haftalık) için uygun sıcaklık 23-30 °C'dir.
   11. Anne tavşanı yavru tavşanlardan ayırın ve emzirmek için bölmeyi günde sadece bir kez açın.
       NOT: Bu, yavru tavşanların anne tavşanın meme ucunu ısırmasını önleyebilir.
2. Anne tavşanın doğum sonrası bakımı
   1. Emzirme döneminde, anne tavşanların serbestçe içmelerine ve yemelerine izin verin ve yeterli beslenmeyi sağlamak için onları uygun yeşil yemle besleyin.
   2. Anne tavşan mastitis hastasıysa, emzirmeyi derhal durdurun ve tedavi için uygun veteriner antibiyotiklerini uygulayın (sefalosporinler önerilir). Genç tavşanları benzer doğum sürelerine sahip diğer emziren anne tavşanlara besleyin.

6. Ablaktasyon

1. Genç tavşanların çoğunun 35 günlükken sütten kesildiğinden emin olun. Zayıf tavşanlar 40 günlükken sütten kesilir.
   NOT: Genç tavşanlar (3 haftadan 3 aya kadar) için uygun sıcaklık 20-25 °C'dir. Genç tavşanlar (3-6 aylık) ve yetişkin tavşanlar için uygun sıcaklık da 15-25 °C'dir.
2. Sütten kesildikten sonra geleneksel aşıların deneysel gerekliliklere göre aşılanıp aşılanmayacağını düşünün.

Sonuçlar

Bu makale, embriyo transferi yapılan ve genetiği değiştirilmiş tavşanlar için bir hamilelik ve beslenme yönetimi prosedürünü açıklamaktadır. 2022'nin sonunda, yazarın laboratuvarı, geni değiştirilmiş tavşanlar için bir hazırlık platformunun geliştirilmesini başlattı. Bu dönemde, kürtaj, zamanında doğum yapamama, distosi, doğumdan önce yuva hazırlığı için saç koparmama, anne tavşanların emzirme isteksizliği veya yamyamlık olayları, büyük çöp ...

Tartışmalar

Embriyo transferi yapılan ve genetiği değiştirilmiş tavşanların gebelik ve hemşirelik yönetimindeki ana adımlar ebelik ve erken yardımlı emzirmeyi içerir. Zor doğum tavşanlarda sık görülen bir sorundur¹⁹. Uzun doğum süreleri genellikle fetal iskemi, hipoksi ve ölümle sonuçlanır²⁵. Oksitosinin uygun kullanımı, doğum sürelerini etkili bir şekilde kısaltabilir ve fetal distosi vakalarını azaltabilir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290