胚胎转移和转基因兔的妊娠和哺乳管理

摘要

该方案描述了一种胚胎移植和转基因兔的妊娠和喂养管理技术，旨在降低新生兔死亡率并提高基因编辑兔的制备效率。

摘要

随着科学研究的进步，对基因编辑兔模型的需求越来越大。然而，基因编辑兔的怀孕和喂养管理系统有限，导致许多缺乏经验的研究人员制备的基因编辑兔的存活率较低。因此，适当的指导是必不可少的。本文总结了作者实验室开发的转基因兔的怀孕和喂养方法，并概述了一组基本过程。这些包括怀孕诊断、产前保健、助产、辅助母乳喂养、断奶和其他程序，以及拯救和照顾虚弱的新生兔子。与兔子养殖场使用的传统自然分娩和养育方法相比，这种方法涉及更精细的管理，需要额外的时间和精力，但显着提高乳兔的存活率。本文介绍的方法适用于大多数涉及基因编辑或胚胎移植兔的实验室育种场景，并为其他研究人员提供了直接有效的参考。

引言

兔子是生物医学研究的经典动物模型，正日益成为弥合啮齿动物模型和大型动物模型之间差距的首选转化模型 ^1,2。与大型动物相比，兔子体型适中，取食空间小，取食成本低，采血方便，有利于重复收集研究数据和手术作。兔子的特点是繁殖能力好、妊娠期短（新西兰白兔为 28-32 天）、出生数量多、生长快 ^3,4。与啮齿动物相比，兔子在系统发生⁵ 上更接近人类。它是猪和非人灵长类动物⁶ 的经济高效且实用的实验替代品。与其他大中型基因编辑动物（猪、牛、羊、猫、狗、猴）相比，基因编辑兔的制备成本低，周期短。随着基因治疗 ^7,8,9、干细胞治疗¹⁰、^11、12、13、脑科学研究¹⁴ 和其他科学领域的发展 1,15,16,17,18，基因编辑中对非啮齿动物物种的需求正在增加。

基因编辑兔曾被认为是能够实现工业应用的中型基因编辑动物之一⁶.然而，直到今天，基因编辑兔还未能实现大规模生产。其中一个主要原因是基因编辑兔的生产和饲养具有挑战性，难度远大于基因编辑小鼠或大鼠。能够高效培养基因编辑兔子的实验室并不多。初学者往往很难成功地制备出基因编辑兔子，他们经常会遇到诸如怀孕率低¹⁹、流产²⁰、难产²¹、母兔拒绝哺乳²² 和乳兔死亡²³ 等令人不快的问题。然而，关于基因编辑兔或胚胎移植兔的怀孕和喂养的系统数据或文献指南很少。他们中的大多数都是基于普通兔子养殖场的经验。

因此，本文总结了作者实验室对转基因兔进行妊娠和护理管理的成熟经验，介绍了胚胎转移兔和转基因兔的一套基本流程，包括妊娠诊断、产前保健、助产、人工辅助喂养、泌乳，以及虚弱小兔子的抢救和护理。这个过程是专门为培育基因编辑兔或胚胎移植兔而建立的。与兔子养殖场传统的自然分娩养育方式相比，孕育管理模式需要更多的时间和精力，但可以大大降低小兔子的死亡率，付出的努力是值得的。

研究方案

所有实验方案均经广东省医学实验动物中心动物实验伦理委员会批准。本研究涉及的 MKRN3 基因修饰兔育种的伦理审查编号为 B202210-6。该研究遵循符合 1975 年赫尔辛基宣言（1983 年修订）中概述的道德标准的程序。本研究中使用的新西兰兔子购自中国广东医学实验动物中心。本文所描述的转基因兔的怀孕和喂养过程，是笔者实验室日常动物饲养实践的总结。材料表中列出了有关试剂和所用设备的详细信息。

1. 怀孕诊断

1. 胚胎移植后^第 12 天至^第 14 天（选择其中一个时间点），通过直接触诊确认怀孕。
   注意：可以跳过此步骤。如果触诊过于粗暴和用力，则可能导致怀孕的兔子流产。
   1. 一只手托住兔子耳后的脖子皮肤，让兔子的臀部向前收缩，靠近兔子臀部的腹腔，然后用另一只手张开手掌，轻轻触诊腹部后端。
   2. 压迫腹部到一定程度。如果触诊到一串连续的光滑有弹性的肉球，大小与蚕豆相似，则认为怀孕²⁴。
2. 如果条件允许，在胚胎移植后的^第 15 天使用超声波来确定兔子是否怀孕。兔子的怀孕诊断基于液体暗区中存在小而强的回声点（孕囊）。
3. 在胚胎移植后的第 16^天至第 18^天期间 ，每天早晚观察兔子两次，每次约 15 分钟。如果观察到兔子在分娩或发情期间表现出烦躁不安、呼吸急促、拔毛筑巢等行为，则表明母兔是假怀孕的，没有真正怀孕。
   注意：如果胚胎移植失败，由于黄体激素的减少，雌性兔子在第 16-18^天会出现类似于产妇或发情的假孕。

2. 产前保健

1. 让怀孕的兔子在怀孕期间自由进食，每周添加一次新鲜的绿色饲料。
2. 在胚胎移植后^第 25 天的早晨或晚上，将怀孕的兔子转移到分娩笼中。
   1. 提前对送货笼、动物培养箱、纸屑或刨花进行消毒。
      注意：选择尺寸符合国际标准的兔子送货笼。确保送笼有足够的空间让兔妈妈活动。选择可以抵抗母兔啃咬的培养箱。选择吸水性好的厚纸屑。根据当地动物设施管理的要求和建议，选择合适的消毒方法。
   2. 将孵化器固定在分娩笼的一侧，将毛巾、刨花或纸屑放入动物孵化器中，供怀孕的兔子筑巢。
   3. 提供充足的饲料和饮用水。
   4. 轻轻地将怀孕的兔子移到分娩笼中。
   5. 注意怀孕的兔子是否每天都在孵化箱里筑巢。如果没有，请在怀孕^第 28 天的早上在保温箱外添加一些纸屑和毛巾。
      注意：如果怀孕的兔子不在保温箱中筑巢，它可能不会在保温箱中分娩。在保温箱外放一些毛巾和纸屑，以防止新生兔子在箱外失温死亡。

3. 分娩

注意：第 0 天是指受精和原核生物形成后不久。兔子是刺激排卵的动物，交配后 10-12 小时排卵。交配后第二天获得的单细胞期胚胎被认为是第 0.5^天。 如果单细胞期胚胎在 体外 仅培养 2-3 小时，然后转移到代孕兔子身上，也被认为是怀孕^的第 0.5 天。

1. 产前监测
   注意：兔子的妊娠期为 28-32 天。如果兔子在怀孕^第 30 天之前分娩，胎儿的大小通常相对较小，并且有罕见的难产情况。^第 30 天之前不需要过度干预。
   1. 在兔子怀孕^第 30 天的早晨，进行腹部触诊以大致确定胎儿的数量、大小和活动。
      1. 一只手托住兔子耳后的脖子皮肤，让兔子的臀部向前收缩，靠近兔子臀部的腹腔，然后用另一只手张开手掌，轻轻触诊腹部后端。力必须很轻。
         注意：按压到腹部一定程度会触诊几个鸡蛋大小的椭球体，可以感觉到胎儿的运动。
   2. 如果发现怀孕兔子受孕的胎儿数量只有 1-2 个，在怀孕^第 30 天，下午 5 点肌肉注射 0.02 毫克氯前列醇，以诱导兔子第二天分娩。
      注意：怀孕的兔子只有 1-2 个胎儿，成熟后容易难产或分娩失败。
2. 加速分娩
   注意：如果怀孕的兔子在怀孕^第 31 天的早上没有分娩，可以根据以下情况考虑是否需要加速分娩。如果胎儿超过 2 个，则不会采取进一步的行动。
   1. 如果怀孕的兔子只怀有 1-2 个胎儿，并且前一天已经注射了氯前列醇，则在怀孕^第 31 天的早晨，将 10 单位的催产素注射到肌肉中以引产。
   2. 如果怀孕的兔子有分娩的迹象（如烦躁不安、呼吸急促、耳血管扩张、拔毛筑巢、平地等），向肌肉注射 10 单位的催产素以引产。
   3. 如果怀孕的兔子没有分娩迹象并且胎动正常，请继续观察。如果怀孕^第 32 天早上没有分娩，将 10 单位的催产素注射到肌肉中以引产。
      注意：通常，使用催产素可以解决困难的分娩。一般在注射催产素后 5-10 分钟，怀孕的兔子就会开始分娩。催产素有效约半小时，半小时后可再次给药。不建议用催产素引产超过 3 次。如果催产素无效，请兽医进行剖宫产。否则，胎儿会在子宫内死亡，软化并从阴道排出。

4. 助产士

1. 安排并准备培养箱（图 1）。
   注意：兔子分娩前提前准备。本研究中使用的培养箱尺寸为 45 厘米× 30 厘米×长 15 厘米×宽 × 高 15 厘米。
   1. 添加无菌吸收剂填充物。建议使用玉米芯颗粒。
   2. 铺一条毛巾作为垫子，上面覆盖着人造羽绒棉。
      注意：人造羽绒棉的材料是婴儿级聚酯纤维，无毒。人造羽绒棉非常适合新生兔子保暖。但是，它不能用来给母兔筑巢，或者可以吃进肚子里。
2. 用毛巾快速擦拭新生兔子身上的粘液。确保它们呼吸顺畅，然后放入培养箱中。
   注意：如果新生兔子的呼吸停止，立即按压胸部进行辅助呼吸（25-35 次/分钟），使胸口直径减少 25%-30%，直到恢复自主呼吸。
3. 怀孕的兔子出生后，统计出生的胎儿数量。在培养箱上贴上信息卡：修饰基因、新生兔子数量、出生日期等。
   注意：新生兔的适宜环境温度为 30-32 °C。 在培养箱内放置适量的兔毛或人造羽绒棉，可以达到良好的保温效果。兔舍应保持在 16-25 °C。 母兔通常有 6-8 个。如果婴儿太多，一些婴儿可以由其他母兔喂养。

5. 产后护理

1. 婴儿兔子护理（图 2）
   注意：分娩后，让母兔休息约 1 小时后再进行母乳喂养。兔子通常每天母乳喂养 1-3 次。
   1. 第一次喂食前，用酒精棉清洁母兔的所有。除母乳喂养外，其他时间将母兔和小兔分开饲养。
   2. 轻轻按摩每个奶嘴，轻轻挤出第一滴奶。
   3. 喂养 1-2 日龄的小兔子：每次将母兔以侧卧位或俯卧位放在垫子上，然后将吸吮兔一个一个地放在它们的上吸吮奶（图 2A）。1-2 日龄的兔子需要每天喂食 2-3 次。
      注意：早产儿兔或低出生体重的小兔子容易出现低血糖症。喂食 1 mL 5% 葡萄糖并尽快食用母乳。如果小兔子虚弱到不能喝水，那就直接将 1 mL 的 5% 葡萄糖注入腹腔。
   4. 出生后的第二天，用记号笔给每只小兔子的背部编号。修剪少量尾部组织以进行基因分型。
   5. 喂养 2 天以上的小兔子：喂食时，将母兔放入保温箱中，让它自己母乳喂养（图 2B）。2-9 日龄的兔子需要每天喂食 1-2 次，9 日龄以上的兔子需要每天喂食一次，直到断奶。确保小兔子吃饱了（图 2C）。
      注意：如果兔妈妈不愿意母乳喂养，可以给它喂一些新鲜蔬菜，让它更愿意合作。如有必要，可以将母兔置于稳定的位置后进行母乳喂养。轻轻挤出母兔每个的第一滴奶，缓解乳房肿胀和疼痛，有利于小兔子吸吮奶水。如果以上方法无效，应使用其他哺乳期母兔进行母乳喂养。
   6. 在出生后的前 4 天内，每天用湿棉球清洁小兔子的会阴两次，以刺激胎粪和尿液的排泄（图 2D）。
   7. 随着小兔子的毛发长大，每天从培养箱中取出一些羽绒棉。
   8. 每天换一次毛巾，直到小兔子长到全身都被毛发覆盖的程度。
      注意：一般来说，出生后^第 8 天不再需要毛巾。
   9. 如果婴儿兔子（1-2 周龄）出现腹泻，请立即连续 5 天每天两次喂养 3 滴动物级庆大霉素（浓度为 0.04 g/mL）。
      注意：小兔子的腹泻通常是由于吸吮患有乳腺炎的母兔的奶汁，或由环境的高温高湿引起的。患有腹泻的婴儿兔子的死亡率非常高。
   10. 幼兔睁开眼睛后（约 2 周大），用毛巾将其移至哺乳笼中。添加一些绿色饲料和日常饮食。
       注意：婴儿兔子（2-3 周大）的适宜温度为 23-30 °C。
   11. 将母兔与小兔分开，每天只打开挡板一次进行母乳喂养。
       注意：这可以防止小兔子咬到母兔的。
2. 母兔的产后护理
   1. 在哺乳期，让兔妈妈自由饮水和进食，并用适当的绿色饲料喂养它们，以确保充足的营养。
   2. 如果母兔患有乳腺炎，请立即停止母乳喂养，并给予适当的兽用抗生素进行治疗（建议使用头孢菌素）。将幼兔喂给其他分娩时间相似的哺乳期母兔。

6. 乳蜜

1. 确保大多数幼兔在 35 日龄时断奶。虚弱的兔子在 40 日龄断奶。
   注意：幼兔（3 周至 3 个月大）的适宜温度为 20-25 °C。 幼兔（3-6 个月大）和成年兔的适宜温度也是 15-25 °C。
2. 断奶后考虑是否根据实验要求接种常规疫苗。

结果

本文介绍了胚胎移植和转基因兔的怀孕和喂养管理程序。2022年底，作者实验室启动了基因改造兔制备平台的开发。在此期间，遇到了几个常见问题，包括流产、足月未分娩、难产、分娩前未拔毛备巢、母兔不愿母乳喂养或同类相食事件、窝产量大导致母乳不足、小兔子不喝奶。这些挑战显著降低了基因改造兔的繁殖效率。

通过总结经验并从这些问题...

讨论

胚胎移植和转基因兔的怀孕和护理管理的主要步骤包括助产和早期辅助母乳喂养。难产是兔子的常见问题¹⁹。延长的分娩时间通常会导致胎儿缺血、缺氧和死亡²⁵。适当使用催产素可以有效缩短分娩时间并减少胎儿难产的情况²⁶.许多初产母兔无法拔毛准备筑巢，这增加了新生兔子温度流失和死亡的风险^27,28...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290