胚移植ウサギおよび遺伝子組換えウサギの妊娠・看護管理

要約

このプロトコルは、胚移植および遺伝子組み換えウサギの妊娠および摂食管理技術について説明しており、新生ウサギの死亡率を減らし、遺伝子編集ウサギの調製効率を高めることを目的としています。

要約

科学研究の進歩に伴い、遺伝子編集されたウサギモデルの需要が高まっています。しかし、遺伝子編集ウサギの妊娠・摂食管理システムは限られており、経験の浅い研究者が多い遺伝子編集ウサギの生存率は低いとされています。そのため、適切な指導が不可欠です。この記事では、著者の研究室で開発された遺伝子組み換えウサギの妊娠と摂食の方法をまとめ、一連の基本的なプロセスを概説します。これらには、妊娠診断、出産前ケア、助産、母乳育児の補助、離乳、その他の手順、および弱った新生児のウサギの救助とケアが含まれます。ウサギ農場で行われている従来の自然分娩や養育方法と比較して、このアプローチはより洗練された管理を伴い、追加の時間と労力を必要としますが、哺乳ウサギの生存率を大幅に向上させます。この記事で説明した方法は、遺伝子編集ウサギまたは胚移植ウサギを含むほとんどの実験室育種シナリオに適しており、他の研究者にとって簡単で効果的な参照を提供します。

概要

ウサギは生物医学研究の古典的な動物モデルであり、げっ歯類モデルと大型動物モデルとの間のギャップを埋めるために、ますます好ましいトランスレーショナルモデルになりつつあります^1,2。大型動物と比較して、ウサギは適度な体型、小さな給餌スペース、低い給餌コスト、便利な採血を備えているため、研究データの収集や外科手術の繰り返しに役立ちます。ウサギは、優れた繁殖能力、短い妊娠期間(ニュージーランドの白ウサギの場合は28〜32日)、多数の出生、および^急速な成長を特徴としています^3,4。げっ歯類と比較して、ウサギは系統発生において人間に近い⁵。これは、ブタおよび非ヒト霊長類⁶の費用対効果が高く実用的な実験的代替品です。他の大型および中型の遺伝子編集動物(ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、サル)と比較して、遺伝子編集ウサギの調製コストは低く、サイクルが短いです。遺伝子治療^7,8,9、幹細胞治療10,11,12,13、脳科学研究¹⁴、およびその他の科学分野^{1,15,16,17,18}の発展に伴い、遺伝子編集における非げっ歯類種の需要が高まっています。

遺伝子編集ウサギは、かつては産業応用を実現できる中型遺伝子編集動物の1つと考えられていました⁶。しかし、今日まで遺伝子編集ウサギは大規模な生産を達成することができませんでした。その主な理由の一つは、遺伝子編集ウサギの作製と育種が困難であり、その難易度が遺伝子編集マウスやラットよりもはるかに大きいことです。遺伝子編集ウサギを効率よく培養できる研究室は多くありません。初心者が遺伝子編集ウサギをうまく作製することはしばしば困難であり、妊娠率の低下¹⁹、流産²⁰、難産²¹、雌ウサギの授乳拒否²²、哺乳ウサギの死亡²³などの不快な問題に遭遇することがよくあります。しかし、遺伝子編集ウサギや胚移植ウサギの妊娠や摂食に関する系統的なデータや文献ガイドラインはほとんどありません。それらのほとんどは、通常のウサギ農場の経験に基づいています。

したがって、この記事では、著者の研究室からの遺伝子組み換えウサギの妊娠と授乳管理の成熟した経験を要約し、妊娠診断、出生前ケア、助産、人工補助給餌、授乳、および虚弱な赤ちゃんウサギの救助と授乳を含む、胚移植ウサギと遺伝子組み換えウサギの一連の基本的なプロセスを紹介します。このプロセスは、遺伝子編集ウサギまたは胚移植ウサギの繁殖のために特別に確立されています。ウサギ農場の伝統的な自然な出産と養育方法と比較して、妊娠と授乳の管理モデルはより多くの時間とエネルギーを要しますが、赤ちゃんウサギの死亡率を大幅に減らすことができ、努力はそれだけの価値があります。

プロトコル

すべての実験プロトコルは、広東省医学実験動物センターの動物実験倫理委員会によって承認されました。本試験に関わったMKRN3遺伝子改変ウサギの育種の倫理審査番号はB202210-6です。この研究は、1975年のヘルシンキ宣言(1983年改訂)に概説されている倫理基準に準拠した手順を遵守しています。この研究で使用されたニュージーランドのウサギは、中国の広東省医学実験動物センターから入手しました。この記事に記載されている遺伝子組み換えウサギの妊娠と摂食のプロセスは、著者の研究室での日常的な動物の繁殖慣行の要約です。試薬および使用した機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 妊娠診断

1. 胚移植後12^日目から 14^日目 (いずれかの時点を選択)に、直接触診で妊娠を確認します。
   注: この手順はスキップできます。触診が乱暴で力強いと、妊娠中のウサギの流産につながる可能性があります。
   1. 片手でウサギの耳の後ろに首の皮膚を持ち、ウサギの臀部をウサギの臀部の腹腔に近づけて前方に収縮させ、もう一方の手で手のひらを開き、腹部の後端を優しく触診します。
   2. 腹部をある程度押します。ソラマメに似たサイズの滑らかで弾力性のある肉球の連続したストリングが触診された場合、それは妊娠と見なされます²⁴。
2. 条件が許せば、胚移植後15^日目 に超音波を使用して、ウサギが妊娠しているかどうかを判断してください。ウサギの妊娠診断は、液体の暗部に小さくて強いエコー源性点(妊娠嚢)が存在することに基づいています。
3. 胚移植後16^〜18^日目の 期間に、ウサギを1日2回、朝と夕方に、それぞれ約15分間観察します。うさぎが陣痛や発情中に落ち着きのなさ、急速な呼吸、巣を作るために毛を抜くなどの行動を示すことが観察された場合、それは雌のうさぎが偽妊娠しており、本当に妊娠していないことを示しています。
   注:胚移植が失敗した場合、雌ウサギは黄体ホルモンの減少により、16^〜18^日目に 分娩または発情と同様の偽妊娠をします。

2.産前ケア

1. 妊娠中のウサギが妊娠中に自由に食事をできるようにし、週に一度新鮮な緑の飼料を追加します。
2. 胚移植後25^日目 の朝または夕方に、妊娠中のウサギを分娩ケージに移します。
   1. 分娩ケージ、動物用保育器、紙くず、または削りくずを事前に消毒してください。
      注:サイズの国際的な基準を満たすウサギの分娩ケージを選択してください。分娩ケージに母ウサギが動くのに十分なスペースがあることを確認してください。母ウサギのニブルに抵抗できるインキュベーターを選択してください。吸水性の良い厚手の紙くずを選びましょう。地元の動物施設管理者の要件と提案に従って、適切な消毒方法を選択してください。
   2. インキュベーターを分娩ケージの片側に固定し、タオル、削りくず、または紙くずを動物のインキュベーターに入れて、妊娠中のウサギが巣を作るようにします。
   3. 十分な飼料と飲料水を提供します。
   4. 妊娠中のウサギをそっと分娩ケージに移動します。
   5. 妊娠中のウサギが毎日インキュベーターに巣を作っているかどうかに注意してください。そうでない場合は、妊娠28^日目 の朝にインキュベーターの外に紙くずとタオルを追加します。
      注:妊娠中のウサギがインキュベーターに巣を作らない場合、インキュベーターで出産しない可能性があります。生まれたばかりのウサギが体温を下げて箱の外で死ぬのを防ぐために、インキュベーターの外にタオルと紙片を置きます。

3. 分娩

注:0日目は、受精と原核生物の形成直後を指します。ウサギは、交配後10〜12時間で排卵する排卵刺激動物です。交配の翌日に得られた単細胞期の胚は、0.5^日目の ものと考えられます。単細胞期の胚を in vitro で2〜3時間だけ培養し、その後代理ウサギに移植した場合も、妊娠0.5^{日目と見なされます} 。

1. 出生前モニタリング
   注:ウサギの妊娠期間は28-32日です。ウサギが妊娠30^日目より 前に出産した場合、胎児のサイズは通常比較的小さく、まれに困難な陣痛のケースがあります。30^日目 までは過度の介入は必要ありません。
   1. ウサギの妊娠30^日目の 朝に、腹部触診を行い、胎児の数、大きさ、活動を大まかに判断します。
      1. 片手でウサギの耳の後ろに首の皮膚を持ち、ウサギの臀部をウサギの臀部の腹腔に近づけて前方に収縮させ、もう一方の手で手のひらを開き、腹部の後端を優しく触診します。力は軽くなければなりません。
         注:腹部をある程度押すと、卵サイズの楕円体がいくつか触診され、胎児の動きを感じることができます。
   2. 妊娠中のウサギが妊娠した胎児の数がわずか1〜2人であることが判明した場合は、妊娠30日目に午後5時に0.02mgのクロプロステノールを筋肉内注射して、翌日のウサギの分娩を誘発します。.
      注:妊娠中のウサギには1〜2人の胎児しかおらず、成熟すると難産や分娩不全になりやすいです。
2. 分娩を早める
   注:妊娠中のウサギが妊娠31^日目 の朝に出産しない場合、次の条件に従って分娩を早める必要があるかどうかを検討できます。胎児が2人以上いる場合、それ以上の措置は取られません。
   1. 妊娠中のウサギが1〜2人の胎児のみを妊娠しており、前日にクロプロステノールを注射した場合は、妊娠31^日目の 朝に、10単位のオキシトシンを筋肉に注射して陣痛を誘発します。
   2. 妊娠中のウサギに出産の兆候(落ち着きのなさ、急速な呼吸、耳の血管拡張、巣を摘んで作る、地面の計画など)がある場合は、10単位のオキシトシンを筋肉に注入して陣痛を誘発します。
   3. 妊娠中のウサギに出産の兆候がなく、胎児の動きが正常である場合は、観察を続けてください。妊娠32^日目 の朝に分娩がない場合は、筋肉にオキシトシンを10単位注入して陣痛を誘発します。
      注:通常、オキシトシンを使用すると、困難な労働を解決できます。通常、オキシトシン注射の5〜10分後に、妊娠中のウサギは分娩を開始します。オキシトシンは約30分間効果があり、30分後に再度投与することができます。オキシトシンで3回以上分娩を誘発することはお勧めしません。オキシトシンが効果がない場合は、獣医師に帝王切開を行ってもらいます。さもなければ、胎児は子宮内で死に、柔らかくなり、そして膣から排出されます。

4.助産師

1. インキュベーターを配置して準備します(図1)。
   注:ウサギが出産する前に事前に準備してください。この研究で使用したインキュベーターのサイズは、長さ 45 cm × 30 cm × 15 cm ×幅×高さです。
   1. 滅菌吸収性パッドを追加します。コーンコブ顆粒が推奨されます。
   2. 人工ダウンコットンで覆われたマットとしてタオルを広げます。
      注:人工ダウンコットンの素材はベビーグレードのポリエステル繊維で、無毒です。人工ダウンコットンは、新生児のウサギが暖かく保つのに非常に適しています。ただし、母ウサギの巣を作るために使うことはできませんし、胃袋に食べられてしまうこともあります。
2. 新生児のウサギの粘液をタオルですばやく拭きます。それらがスムーズに呼吸することを確認してから、インキュベーターに入れます。
   注:新生児のウサギの呼吸が止まった場合は、すぐに胸部を押して補助呼吸(25〜35回/分)し、自発呼吸が回復するまで胸部の直径を25%〜30%減らします。
3. 妊娠中のウサギの出産後、生まれた胎児の数を数えます。インキュベーターに情報カードを貼り付けます:改変遺伝子、新生ウサギの数、生年月日など。
   注:新生児のウサギに適した環境温度は30〜32°Cです。 インキュベーター内にウサギの毛や人工ダウンコットンを適量入れると、良好な断熱効果が得られます。ウサギの家は16-25°Cに維持する必要があります。 雌ウサギは通常6〜8個の乳首を持っています。赤ちゃんが多すぎると、他の母ウサギに餌をやられる赤ちゃんもいます。

5.産後のケア

1. ウサギの赤ちゃんの世話(図2)
   注:出産後、母ウサギを約1時間安静にしてから授乳してください。ウサギは通常、1日1〜3回母乳で育てます。
   1. 最初の給餌の前に、母ウサギのすべての乳首をアルコール綿できれいにします。母乳育児以外は、母ウサギと赤ちゃんウサギを別々に飼ってください。
   2. 各乳首を優しくマッサージし、ミルクの最初の一滴をそっと絞り出します。
   3. 生後1〜2日の赤ちゃんウサギの給餌:毎回、母ウサギをマットの上に横向きまたは腹臥位で置き、吸うウサギを1匹ずつ乳首に置いてミルクを吸います(図2A)。生後1〜2日のウサギには、1日2〜3回餌を与える必要があります。
      注:未熟児ウサギまたは低出生体重の赤ちゃんウサギは低血糖になりやすいです。5%グルコース1mLを与え、できるだけ早く母乳を摂取してください。赤ちゃんウサギが飲むには弱すぎる場合は、1 mLの5%グルコースを腹腔内に直接注入します。
   4. 生後2日目に、マーカーペンを使って各子ウサギの背中に番号を付けます。ジェノタイピングのために少量の尾組織をトリミングします。
   5. 生後2日以上の赤ちゃんウサギへの授乳:授乳するときは、母ウサギをインキュベーターに入れ、自然に母乳を与えてください(図2B)。生後2〜9日のウサギには1日1〜2回、生後9日以上のウサギには離乳するまで1日1回の給餌が必要です。赤ちゃんウサギがいっぱいであることを確認してください(図2C)。
      注:母ウサギが母乳育児をしたくない場合は、新鮮な野菜を与えて、協力する意欲を高めることができます。必要ならば、母ウサギは安定した位置に置かれた後に母乳を与えることができます。母ウサギの各乳首から最初の一滴のミルクをそっと絞り出して、乳房の腫れや痛みを和らげます。上記の方法が効果的でない場合は、他の授乳中の母ウサギを母乳育児に使用する必要があります。
   6. 生後最初の4日間は、赤ちゃんウサギの会陰を1日2回、濡れた綿球で洗浄し、胎便と尿の排泄を刺激します(図2D)。
   7. 赤ちゃんウサギの毛が成長するにつれて、毎日インキュベーターからダウンコットンを取り除きます。
   8. 赤ちゃんうさぎが全身に毛が生えるほど大きくなるまで、1日1回タオルを交換してください。
      注:通常、生後^{8日目には} タオルは不要になります。
   9. 赤ちゃんウサギ(生後1〜2週間)が下痢をした場合は、すぐに動物グレードのゲンタマイシン(濃度0.04 g / mL)を3滴、1日2回、5日間連続して給餌してください。
      注:赤ちゃんウサギの下痢は通常、乳房炎の母ウサギからミルクを吸うこと、または環境の高温多湿によって引き起こされます。下痢のある赤ちゃんウサギの死亡率は非常に高いです。
   10. 若いウサギが目を開けた後(生後約2週間)、タオルで授乳ケージに移します。いくつかの緑の飼料と毎日の食事療法を追加します。
       注:赤ちゃんウサギ(生後2〜3週間)の適切な温度は23〜30°Cです。
   11. 母ウサギを赤ちゃんウサギから分離し、母乳育児のために1日1回だけバッフルを開けます。
       注:これにより、赤ちゃんウサギが母ウサギの乳首を噛むのを防ぐことができます。
2. 母ウサギの産後ケア
   1. 授乳中は、母ウサギが自由に飲んだり食べたりできるようにし、適切な緑色の飼料を与えて十分な栄養を確保します。
   2. 母ウサギが乳房炎にかかっている場合は、直ちに母乳育児を中止し、治療のために適切な獣医用抗生物質を投与してください(セファロスポリンが推奨されます)。若いウサギを他の授乳中の母ウサギに、同様の配達時間で与えます。

6.アブラクト

1. ほとんどの若いウサギが35日齢で離乳することを確認してください。弱いウサギは40日齢で離乳します。
   注:若いウサギ(生後3週間から3ヶ月)の適切な温度は20〜25°Cです。 若いウサギ(生後3〜6か月)と成体のウサギに適した温度も15〜25°Cです。
2. 離乳後の実験的要件に従って、従来のワクチンにワクチンを接種するかどうかを検討します。

結果

この記事では、胚移植ウサギおよび遺伝子組み換えウサギの妊娠および摂食管理手順について説明します。2022年末、筆者の研究室では、遺伝子改変ウサギの調製プラットフォームの開発に着手しました。この期間中、中絶、正期産の失敗、難産、出産前の巣の準備のために毛を抜かなかった、母ウサギの母乳育児への抵抗や共食いの事件、同腹児数が多いことによ?...

ディスカッション

胚移植ウサギや遺伝子組み換えウサギの妊娠管理と授乳管理の主なステップには、助産と早期母乳育児が含まれます。難産はウサギによく見られる問題です¹⁹。分娩時間が長くなると、胎児の虚血、低酸素症、および死亡につながる^{ことがよくあります25}。オキシトシンを適切に使用することで、分娩時間を効果的に短縮し、胎児?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290