Ведение беременности и кормления кроликов, перенесших эмбрионы и генетически модифицированных

Резюме

В данном протоколе описана методика ведения беременности и кормления кроликов, перенесших эмбрионы и генетически модифицированные, направленная на снижение смертности новорожденных кроликов и повышение эффективности подготовки генетически отредактированных кроликов.

Аннотация

С развитием научных исследований растет спрос на генетически отредактированные модели кроликов. Тем не менее, существуют ограниченные системы управления беременностью и кормлением для генетически отредактированных кроликов, что приводит к низким показателям выживаемости среди генетически отредактированных кроликов, подготовленных многими неопытными исследователями. Поэтому правильное руководство имеет важное значение. В данной статье обобщены разработанные в лаборатории автора методы стельности и кормления генетически модифицированных кроликов и изложен ряд фундаментальных процессов. К ним относятся диагностика беременности, дородовой уход, акушерство, вспомогательное грудное вскармливание, отлучение от груди и другие процедуры, а также спасение и уход за слабыми новорожденными кроликами. По сравнению с традиционными методами естественных родов и вскармливания, используемыми в кролиководческих хозяйствах, этот подход предполагает более совершенное управление, требующее дополнительного времени и усилий, но значительно повышающее выживаемость подсосных кроликов. Методы, описанные в этой статье, подходят для большинства сценариев лабораторного разведения кроликов с отредактированными генами или эмбрионами и являются простым и эффективным ориентиром для других исследователей.

Введение

Кролики являются классической животной моделью для биомедицинских исследований и все чаще становятся предпочтительной трансляционной моделью для преодоления разрыва между моделями грызунов и моделями крупных животных ^1,2. По сравнению с крупными животными, кролики имеют умеренные размеры тела, небольшое пространство для кормления, низкую стоимость кормления и удобный забор крови, что способствует повторному сбору данных исследований и хирургическим операциям. Кролики характеризуются хорошей репродуктивной способностью, коротким периодом беременности (28-32 дня для новозеландских белых кроликов), большим количеством родов, быстрым ростом ^3,4. По сравнению с грызунами, кролики ближе к человеку по филогенезу⁵. Это экономически эффективный и практичный экспериментальный заменитель свиней и нечеловекообразных приматов⁶. По сравнению с другими крупными и средними животными для редактирования генов (свиньи, крупный рогатый скот, овцы, кошки, собаки, обезьяны) стоимость подготовки кроликов для редактирования генов низкая, а цикл короткий. С развитием генной терапии ^7,8,9, терапии стволовыми клетками 10,11,12,13, исследований в области мозга ¹⁴ и других научных областей 1,15,16,17,18 спрос на виды без грызунов в редактировании генов увеличивается.

Кролики, занимающиеся редактированием генов, когда-то считались одними из животных среднего размера, которые могли бы реализовать промышленное применение⁶. Однако до сегодняшнего дня кроликам с редактированием генов не удалось добиться широкомасштабного производства. Одна из основных причин заключается в том, что производство и разведение кроликов с редактированием генов является сложной задачей, и сложность намного выше, чем у мышей или крыс с редактированием генов. Существует не так много лабораторий, которые могут эффективно выращивать кроликов с редактированием генов. Новичкам часто бывает сложно успешно подготовить кроликов по редактированию генов, и они часто сталкиваются с такими неприятными проблемами, как низкая стельность¹⁹, аборты²⁰, дистоция²¹, отказ от лактации самками крольчихи²², падеж подсосных крольчат²³. Тем не менее, существует мало систематических данных или литературных рекомендаций по беременности и кормлению кроликов с редактированием генов или кроликов, перенесших эмбрионы. Большинство из них основаны на опыте обычных кролиководческих ферм.

Поэтому в данной статье обобщен зрелый опыт ведения беременности и кормления генетически модифицированных кроликов из авторской лаборатории, а также представлен комплекс основных процессов эмбрионального переноса кроликов и генетически модифицированных кроликов, включая диагностику беременности, дородовое наблюдение, акушерство, искусственное вспомогательное вскармливание, аблактацию, а также спасение и выхаживание слабых крольчат. Этот процесс специально налажен для разведения кроликов с редактированием генов или кроликов, перенесших эмбрионы. По сравнению с традиционным методом естественных родов и вскармливания на кролиководческих фермах, модель ведения беременности и кормления требует больше времени и энергии, но она может значительно снизить смертность крольчат, и усилия того стоят.

протокол

Все протоколы экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Центра медицинских лабораторных животных провинции Гуандун. Номер этического обзора для разведения кроликов с модифицированным геном MKRN3, участвующих в этом исследовании, составляет B202210-6. В исследовании соблюдены процедуры, соответствующие этическим нормам, изложенным в Хельсинкской декларации 1975 года (пересмотренной в 1983 году). Новозеландские кролики, использованные в этом исследовании, были получены из Центра медицинских лабораторных животных провинции Гуандун в Китае. Описанный в этой статье процесс беременности и кормления генетически модифицированных кроликов является кратким изложением ежедневной практики разведения животных в лаборатории автора. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Диагностика беременности

1. На^{12-14 день после} переноса эмбрионов (выберите одну из временных точек) подтвердите беременность путем прямой пальпации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно пропустить. Если пальпация будет слишком грубой и принудительной, это может привести к выкидышу у беременных крольчих.
   1. Одной рукой придерживайте кожу шеи за ушами кролика, дайте ягодицам кролика сжаться вперед, приблизившись к брюшной полости ягодиц кролика, а затем другой рукой раскройте ладонь и аккуратно пропальпируйте задний конец живота.
   2. Надавите на живот до определенной степени. Если прощупать непрерывную нить гладких и эластичных шариков из мякоти, похожих по размеру на бобы конфорки, то считается беременность²⁴.
2. Если позволяют условия, используйте УЗИ на^15-й день после переноса эмбрионов, чтобы определить, беременна ли крольчиха. Диагностика схватки кроликов основывается на наличии небольших, крепких эхогенных точек (гестационных мешочков) в жидкой темной зоне.
3. В период с 16-го^{по 18-й} день после переноса эмбрионов наблюдайте за кроликом два раза в день утром и вечером, примерно по 15 минут каждый раз. Если во время родов или течки наблюдается такое поведение, как беспокойство, учащенное дыхание, выщипывание шерсти для строительства гнезд и т. д., это указывает на то, что самка кролика псевдобеременна и по-настоящему не забеременела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если перенос эмбрионов не удается, у самок крольчихи будет ложная беременность, похожая на роженицу или течку, на 16-18-й день из-за снижения лютеинового гормона.

2. Дородовое наблюдение

1. Позволяйте беременным крольчихам свободно питаться во время беременности и добавляйте свежий зеленый корм раз в неделю.
2. Утром или вечером^25-го дня после переноса эмбрионов переведите беременных крольчих в клетку для родов.
   1. Заранее продезинфицируйте клетку для родов, инкубатор для животных, обрезки бумаги или стружку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте клетку для доставки кроликов, которая соответствует международным критериям по размеру. Убедитесь, что в клетке для родов достаточно места для перемещения крольчихи. Выбирайте инкубатор, который сможет противостоять грызению крольчихи. Выбирайте плотные обрезки бумаги с хорошим водопоглощением. В соответствии с требованиями и предложениями местного руководства животноводческого хозяйства, выберите подходящие методы дезинфекции.
   2. Закрепите инкубатор с одной стороны клетки для родов и положите полотенца, стружку или обрезки бумаги в инкубатор для животных, чтобы беременные крольчихи могли сделать гнездо.
   3. Обеспечьте достаточное количество корма и питьевой воды.
   4. Аккуратно переместите беременных крольчат в клетку для родов.
   5. Обратите внимание на то, сделали ли беременные крольчихи гнездо в инкубаторе каждый день. Если нет, добавьте немного обрезков бумаги и полотенец за пределы инкубатора утром^28-го дня беременности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если беременные крольчихи не гнездятся в инкубаторе, они, скорее всего, не будут рожать в инкубаторе. Положите немного полотенец и обрезков бумаги за пределы инкубатора, чтобы новорожденные кролики не теряли температуру и не умирали вне коробки.

3. Роды

ПРИМЕЧАНИЕ: День 0 относится к вскоре после оплодотворения и образования прокариот. Кролики – животные, стимулирующие овуляцию, у которых происходит овуляция через 10-12 ч после спаривания. Эмбрионы одноклеточной стадии, полученные на следующий день после спаривания, считаются эмбрионами на^0,5-й день. Если эмбрионы одноклеточной стадии культивируют in vitro всего 2-3 ч, а затем переносят суррогатным кроликам, то это также считается^0,5-й день беременности.

1. Пренатальное наблюдение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срок беременности кроликов составляет 28-32 дня. Если крольчиха рожает до^30-го дня беременности, то размеры плода обычно относительно небольшие, и бывают редкие случаи тяжелых родов. До^30-го дня не требуется чрезмерного вмешательства.
   1. Утром^30-го дня беременности у крольчих проводят абдоминальную пальпацию, чтобы примерно определить количество, размеры и активность плода.
      1. Одной рукой придерживайте кожу шеи за ушами кролика, дайте ягодицам кролика сжаться вперед, приблизившись к брюшной полости ягодиц кролика, а затем другой рукой раскройте ладонь и аккуратно пропальпируйте задний конец живота. Сила должна быть легкой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Надавливание на живот в определенной степени приведет к пальпации нескольких эллипсоидов размером с яйцо, которые могут ощущать движение плода.
   2. Если установлено, что количество плодов, зачатых беременными крольчихами, составляет всего 1-2, то на^30-й день беременности в 17 часов внутримышечно вводят 0,02 мг клопростенола, чтобы вызвать роды у крольчат на следующий день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные крольчихи имеют только 1-2 плода, которые склонны к дистоции или срыву родов в зрелом возрасте.
2. Ускорьте роды
   Примечание: Если беременная крольчиха не рожает утром^31-го дня беременности, она может рассмотреть вопрос о том, нужно ли ей ускорить роды в соответствии со следующими условиями. Если плода больше 2, никаких дальнейших действий предпринято не будет.
   1. Если беременная крольчиха беременна только 1-2 плодами и накануне ей ввели клопростенол, утром^31-го дня беременности введите 10 единиц окситоцина в мышцы, чтобы вызвать роды.
   2. Если у беременной крольчихи наблюдаются признаки родов (такие как беспокойство, учащенное дыхание, расширение сосудов уха, выщипывание и изготовление гнезда, планирование грунта и т.д.), введите в мышцы 10 единиц окситоцина, чтобы вызвать родовую деятельность.
   3. Если у беременной крольчихи нет признаков родоразрешения и движения плода в норме, продолжайте наблюдение. Если родов нет утром^32-го дня беременности, введите 10 единиц окситоцина в мышцы, чтобы вызвать роды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, применение окситоцина может решить сложные роды. Как правило, через 5-10 минут после введения окситоцина у беременных крольчих начинаются роды. Окситоцин эффективен в течение примерно получаса и может быть введен повторно через полчаса. Не рекомендуется вызывать роды окситоцином более 3 раз. Если окситоцин неэффективен, попросите ветеринара провести кесарево сечение. В противном случае плод погибнет в матке, размягчится, и будет выделяться из влагалища.

4. Акушерство

1. Обустройте и подготовьте инкубаторы (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь заранее, прежде чем крольчиха родит. Размер инкубатора, использованного в данном исследовании, составляет 45 см × 30 см × 15 см в длину × ширину × высоту.
   1. Добавьте стерильную абсорбирующую набивку. Рекомендуется использовать гранулы кукурузного початка.
   2. Расстелите полотенце в виде коврика, покрытого искусственным пухом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Материалом искусственного пухового хлопка является детское полиэфирное волокно, которое не токсично. Искусственный пух очень подходит для новорожденных кроликов, согревающихся в тепле. Тем не менее, его нельзя использовать для создания гнезда для матери-крольчихи, или он может быть съеден в желудок.
2. Быстро вытрите слизь на новорожденных крольчатах полотенцем. Убедитесь, что они дышат ровно, а затем поместите их в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если дыхание новорожденных крольчат остановилось, немедленно надавите на грудную клетку для вспомогательного дыхания (25-35 раз/мин) для уменьшения диаметра грудной клетки на 25%-30% до восстановления спонтанного дыхания.
3. После рождения беременных крольчих подсчитайте количество родившихся плодов. Наклейте на инкубатор информационные карточки: измененные гены, количество новорожденных крольчат, дата рождения и т.д.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая температура окружающей среды для новорожденных кроликов составляет 30-32 °C. Помещение в инкубатор соответствующего количества кроличьей шерсти или искусственного пухового хлопка может достичь хорошего изоляционного эффекта. В кроличьем домике следует поддерживать температуру 16-25 °C. У самок кроликов обычно 6-8 сосков. Если малышей слишком много, некоторых малышей могут кормить другие крольчата-мамы.

5. Послеродовой уход

1. Уход за крольчатами (Рисунок 2)
   ПРИМЕЧАНИЕ: После родов дайте крольчихе отдохнуть около 1 часа перед кормлением грудью. Кроликов обычно кормят грудью 1-3 раза в день.
   1. Перед первым кормлением очистите все соски крольчихи спиртовой ватой. За исключением грудного вскармливания, в остальное время крольчат и крольчат содержат отдельно.
   2. Аккуратно помассируйте каждый сосок и аккуратно выдавите первую каплю молока.
   3. Кормление 1-2-дневных крольчат: Каждый раз кладите крольчатину на коврик в боковом положении или в положении лежа и прикладывайте сосущих кроликов по одному к их соскам, чтобы они сосали молоко (Рисунок 2А). 1-2-дневных кроликов нужно кормить 2-3 раза в день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недоношенные кролики или крольчата с низкой массой тела при рождении склонны к гипогликемии. Кормите 1 мл 5% глюкозы и употребите грудное молоко как можно скорее. Если крольчиха слишком слаб для питья, то сразу вводят 1 мл 5% глюкозы в брюшную полость.
   4. На второй день после рождения с помощью маркера пронумеруйте спину каждого крольчатина. Обрежьте небольшое количество ткани хвоста для генотипирования.
   5. Кормление крольчат старше 2 дней: Во время кормления поместите крольчатину в инкубатор и дайте ей самостоятельно кормить грудью (Рисунок 2B). 2-9-дневных кроликов нужно кормить 1-2 раза в день, а свыше 9-дневных кроликов нужно кормить один раз в день до отъема. Убедитесь, что крольчата сыты (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если крольчиха не желает кормить грудью, ее можно кормить свежими овощами, чтобы она была более склонна к сотрудничеству. При необходимости крольчат-матерей можно кормить грудью после помещения в устойчивое положение. Аккуратно выдавите первую каплю молока из каждого соска крольчихи, чтобы облегчить набухание и боль в груди, что полезно для крольчат сосать молоко. Если вышеперечисленные методы неэффективны, для кормления следует использовать других кормящих крольчат-матерей.
   6. В течение первых 4 дней после рождения очищайте промежность крольчатина два раза в день влажными ватными шариками, чтобы стимулировать выведение мекония и мочи (рисунок 2D).
   7. По мере того, как шерсть крольчатина отрастает, каждый день убирайте из инкубатора немного пуховой ваты.
   8. Меняйте полотенце один раз в день, пока крольчиха не вырастет до такой степени, что все его тело будет покрыто шерстью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, полотенце больше не нужно на^8-й день после рождения.
   9. Если у крольчат (в возрасте 1-2 недель) наблюдается диарея, немедленно скармливайте 3 капли гентамицина животного происхождения (концентрация 0,04 г/мл) два раза в день в течение 5 дней подряд.
      Примечание: Диарея у крольчат обычно вызвана сосанием молока у крольчат с маститом или высокой температурой и влажностью окружающей среды. Смертность крольчат при диарее очень высока.
   10. После того, как молодой кролик откроет глаза (возраст около 2 недель), переместите его в клетку для кормления с помощью полотенца. Добавьте немного зеленого корма и ежедневный рацион.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая температура для крольчат (в возрасте 2-3 недель) составляет 23-30 °C.
   11. Отделите крольчатину от крольчат и открывайте перегородку только один раз в день для кормления грудью.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помешать крольчатам кусать сосок матери-крольчихи.
2. Послеродовой уход за матерью-крольчихой
   1. Во время лактации позволяйте крольчихам свободно пить и есть и кормите их подходящими зелеными кормами, чтобы обеспечить достаточное питание.
   2. Если крольчиха страдает маститом, немедленно прекратите грудное вскармливание и назначьте соответствующие ветеринарные антибиотики для лечения (рекомендуются цефалоспорины). Скармливайте молодых крольчат другим кормящим крольчихам с аналогичными сроками родов.

6. Аблактация

1. Убедитесь, что большинство молодых кроликов отлучены от груди в возрасте 35 дней. Слабых кроликов отлучают от груди в возрасте 40 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая температура для молодых кроликов (от 3 недель до 3 месяцев) составляет 20-25 °C. Подходящая температура для молодых кроликов (3-6 месяцев) и взрослых кроликов также составляет 15-25 °C.
2. Рассмотрите, следует ли прививать обычные вакцины в соответствии с экспериментальными требованиями после отъема.

Результаты

В данной статье описывается процедура ведения беременности и кормления кроликов, перенесших эмбрионы и генетически модифицированных. В конце 2022 года авторская лаборатория приступила к разработке платформы для подготовки генно-модифицированных кроликов. В течение ?...

Обсуждение

Основными этапами ведения беременности и кормления эмбрионов и генетически модифицированных кроликов являются акушерство и раннее вспомогательное грудное вскармливание. Трудные роды – распространенная проблема у кроликов¹⁹. Длительные сроки родов ча?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290