Pregnancy and Nursing Management for Embryo-Transferred and Genetically Modified Rabbits

요약

이 프로토콜은 배아 이식 및 유전자 변형 토끼에 대한 임신 및 사료 관리 기술을 설명하며, 신생아 토끼 사망률을 줄이고 유전자 편집 토끼의 준비 효율성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

초록

과학 연구의 발전과 함께 유전자 편집 토끼 모델에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 그러나 유전자 편집 토끼에 대한 임신 및 사료 관리 시스템이 제한되어 있어 경험이 부족한 많은 연구자들이 준비한 유전자 편집 토끼의 생존율이 낮습니다. 따라서 적절한 지침이 필수적입니다. 이 기사는 저자의 실험실에서 개발된 유전자 변형 토끼의 임신 및 먹이 섭취 방법을 요약하고 일련의 기본 과정을 간략하게 설명합니다. 여기에는 임신 진단, 산전 관리, 조산사, 모유 수유 보조, 이유 떼기 및 기타 절차와 함께 약한 갓 태어난 토끼의 구조 및 보살핌이 포함됩니다. 토끼 농장에서 사용되는 전통적인 자연 출산 및 양육 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 보다 정교한 관리를 포함하므로 추가 시간과 노력이 필요하지만 젖먹이 토끼의 생존율을 크게 높입니다. 이 기사에서 설명하는 방법은 유전자 편집 또는 배아 이식 토끼와 관련된 대부분의 실험실 육종 시나리오에 적합하며 다른 연구자에게 간단하고 효과적인 참고 자료를 제공합니다.

서문

토끼는 생물의학 연구를 위한 전형적인 동물 모델이며, 설치류 모델과 대형 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 점점 더 선호되는 번역 모델이 되고 있습니다 ^1,2. 토끼는 대형 동물에 비해 몸집이 적당하고 먹이 공간이 작으며 먹이 비용이 저렴하고 채혈이 편리하여 연구 데이터의 반복적인 수집 및 외과 수술에 도움이 됩니다. 토끼는 좋은 번식 능력, 짧은 임신 기간 (뉴질랜드 흰 토끼의 경우 28-32 일), 많은 출산 횟수 및 빠른 성장이 특징입니다 ^3,4. 설치류와 비교했을 때, 토끼는 계통발생⁵에서 인간에 더 가깝다. 돼지와 인간이 아닌 영장류를 대체할 수 있는 비용 효율적이고 실용적인 실험용 대체품입니다⁶. 다른 중대형 유전자 편집 동물(돼지, 소, 양, 고양이, 개, 원숭이)에 비해 유전자 편집 토끼의 준비 비용이 저렴하고 주기가 짧습니다. 유전자 치료제 ^7,8,9, 줄기세포 치료제 10,11,12,13, 뇌과학 연구¹⁴ 및 기타 과학 분야 ^{1,15,16,17,18}의 발전으로 유전자 편집에서 설치류가 아닌 종에 대한 수요가 증가하고 있습니다.

유전자 편집 토끼는 한때 산업적 응용을 실현할 수 있는 중간 크기의 유전자 편집 동물 중 하나로 여겨졌다⁶. 그러나 오늘날까지 유전자 편집 토끼는 대규모 생산을 달성하지 못했습니다. 주된 이유 중 하나는 유전자 편집 토끼의 생산과 번식이 어렵고 유전자 편집 생쥐나 쥐보다 훨씬 더 어렵기 때문입니다. 유전자 편집 토끼를 효율적으로 육성할 수 있는 실험실은 많지 않습니다. 초보자는 유전자 편집 토끼를 성공적으로 준비하기 어려운 경우가 많으며, 낮은 임신율¹⁹, 유산²⁰, 난산²¹, 암토끼22의 수유 거부²², 젖먹이 토끼²³의 죽음과 같은 불쾌한 문제에 자주 직면한다. 그러나 유전자 편집 토끼 또는 배아 이식 토끼의 임신 및 수유에 대한 체계적인 데이터나 문헌 지침은 거의 없습니다. 대부분은 일반 토끼 농장의 경험을 기반으로 합니다.

따라서 본 논문은 저자의 연구실에서 발굴된 유전자 변형 토끼의 임신 및 수유 관리에 대한 성숙한 경험을 요약하고, 임신 진단, 산전 관리, 조산, 인공 보조 수유, 절제, 약한 아기 토끼의 구조 및 수유를 포함하여 배아 이식 토끼와 유전자 변형 토끼의 기본 과정을 소개합니다. 이 과정은 유전자 편집 토끼 또는 배아 이식 토끼를 사육하기 위해 특별히 확립되었습니다. 토끼 농장의 전통적인 자연 출산 및 양육 방법에 비해 임신 및 수유 관리 모델은 더 많은 시간과 에너지가 필요하지만 아기 토끼의 사망률을 크게 줄일 수 있으며 노력은 그만한 가치가 있습니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 광둥성 의학 실험실 동물 센터의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구와 관련된 MKRN3 유전자 변형 토끼 사육에 대한 윤리적 검토 번호는 B202210-6이다. 이 연구는 1975년 헬싱키 선언(1983년 개정)에 명시된 윤리적 기준을 준수하는 절차를 고수합니다. 이 연구에 사용된 뉴질랜드 토끼는 중국 광둥성 의학 실험실 동물 센터에서 얻은 것입니다. 이 기사에 설명된 유전자 변형 토끼의 임신 및 먹이 과정은 저자의 실험실에서 매일 동물 사육 관행을 요약한 것입니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 임신 진단

1. 배아 이식 후 12^일 에서 14^일 째(시점 중 하나 선택)에 직접 촉진을 통해 임신을 확인합니다.
   참고: 이 단계는 건너뛸 수 있습니다. 촉진이 너무 거칠고 강하면 임신한 토끼의 유산으로 이어질 수 있습니다.
   1. 한 손으로 토끼의 귀 뒤의 목 피부를 잡고 토끼의 엉덩이를 앞으로 수축시켜 토끼 엉덩이의 복강 가까이로 한 다음 다른 손으로 손바닥을 펴고 복부 뒤쪽 끝을 부드럽게 촉진합니다.
   2. 복부를 어느 정도 누릅니다. 잠두콩과 비슷한 크기의 매끄럽고 탄력 있는 살덩어리가 연속적으로 형성되면 임신으로 간주된다²⁴.
2. 조건이 허락하는 경우 배아 이식 후 15^일 째에 초음파를 사용하여 토끼의 임신 여부를 확인합니다. 토끼의 임신 진단은 액체 암흑 영역에 작고 강한 반향점(임신 주머니)의 존재를 기반으로 합니다.
3. 배아 이식 후 16^일-18^{일 기간} 동안 아침과 저녁에 하루에 두 번, 매번 약 15분 동안 토끼를 관찰합니다. 토끼가 진통이나 발정 중에 안절부절못하거나, 빠른 호흡을 하거나, 둥지를 짓기 위해 털을 뽑는 등의 행동을 보이는 것이 관찰된다면, 암컷 토끼는 가성 임신 상태이며 실제로 임신하지 않았음을 나타냅니다.
   참고: 배아 이식에 실패하면 암컷 토끼는 황체 호르몬의 감소로 인해 16^일에서 18^{일에 분} 만 또는 발정과 유사한 가임신을 하게 됩니다.

2. 산전 관리

1. 임신한 토끼가 임신 중에 자유롭게 먹을 수 있도록 하고 일주일에 한 번 신선한 녹색 사료를 추가하십시오.
2. 배아 이식 후 25^일 째 아침이나 저녁에 임신한 토끼를 분만 케이지로 옮깁니다.
   1. 분만 케이지, 동물 인큐베이터, 종이 조각 또는 부스러기를 미리 소독하십시오.
      참고: 국제 기준에 맞는 토끼 분만 케이지를 선택하십시오. 분만 케이지에 어미 토끼가 움직일 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 어미 토끼의 갉아먹는 것을 견딜 수 있는 인큐베이터를 선택하십시오. 수분 흡수가 좋은 두꺼운 종이 조각을 선택하십시오. 지역 동물 시설 관리의 요구 사항 및 제안에 따라 적절한 소독 방법을 선택하십시오.
   2. 분만 케이지 한쪽에 인큐베이터를 고정하고 수건, 부스러기, 종이 조각을 동물 인큐베이터에 넣어 임신한 토끼가 둥지를 만들 수 있도록 합니다.
   3. 적절한 사료와 식수를 제공하십시오.
   4. 임신한 토끼를 분만 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
   5. 임신한 토끼가 매일 인큐베이터에 둥지를 틀었는지 주목하십시오. 그렇지 않은 경우 임신 28^일 아침에 인큐베이터 밖에 종이 조각과 수건을 추가하십시오.
      참고: 임신한 토끼가 인큐베이터에 둥지를 틀지 않으면 인큐베이터에서 출산하지 못할 가능성이 높습니다. 갓 태어난 토끼가 체온을 잃고 상자 밖에서 죽는 것을 방지하기 위해 인큐베이터 밖에 수건과 종이 조각을 넣으십시오.

3. 분만

참고: Day 0은 수정 및 원핵 생물 형성 직후를 나타냅니다. 토끼는 짝짓기 후 10-12시간 후에 배란을 하는 배란을 자극하는 동물입니다. 짝짓기 다음 날에 얻은 단세포 단계 배아는 0.5^일 째 되는 날로 간주됩니다. 단세포 단계 배아를 2-3시간 동안만 체외 에서 배양한 후 대리모 토끼에게 이식하는 경우에도 임신 0.5^일 째로 간주됩니다.

1. 산전 모니터링
   참고: 토끼의 임신 기간은 28-32일입니다. 토끼가 임신 30^일 이전에 출산하면 태아의 크기는 일반적으로 상대적으로 작고, 드물게 힘든 분만 사례가 있습니다. 30^일 째 이전에는 과도한 개입이 필요하지 않습니다.
   1. 토끼의 경우 임신 30^일 아침에 복부 촉진을 수행하여 태아의 수, 크기 및 활동을 대략적으로 확인합니다.
      1. 한 손으로 토끼의 귀 뒤의 목 피부를 잡고 토끼의 엉덩이를 앞으로 수축시켜 토끼 엉덩이의 복강 가까이로 한 다음 다른 손으로 손바닥을 펴고 복부 뒤쪽 끝을 부드럽게 촉진합니다. 힘은 가벼워야 합니다.
         참고: 복부를 어느 정도 누르면 태아의 움직임을 느낄 수 있는 여러 개의 달걀 크기의 타원체가 촉진됩니다.
   2. 임신한 토끼가 임신한 태아의 수가 1-2명에 불과한 것으로 판명되면 임신 30^일 째 오후 5시에 클로프로스테놀 0.02mg을 근육 주사하여 다음날 토끼의 출산을 유도한다.
      참고: 임신한 토끼는 태아가 1-2명뿐이며 성숙했을 때 난산이나 분만 실패가 발생하기 쉽습니다.
2. 분만을 서두르다
   참고: 임신한 토끼가 임신 31^{일 아침에} 출산하지 않으면 다음 조건에 따라 출산을 서두를 필요가 있는지 여부를 고려할 수 있습니다. 태아가 2명 이상인 경우 추가 조치가 취해지지 않습니다.
   1. 임신한 토끼가 1-2명의 태아만 임신하고 전날 클로프로스테놀을 주사한 경우, 임신 31일째 아침에 근육에 옥시토신 10단위를 주입하여 진통을 유도합니다.
   2. 임신한 토끼에게 출산 징후(예: 안절부절못함, 빠른 호흡, 귀 혈관 확장, 뽑기 및 둥지 만들기, 땅 계획 등)가 있으면 근육에 옥시토신 10단위를 주입하여 진통을 유도합니다.
   3. 임신한 토끼가 분만의 징후가 없고 태아의 움직임이 정상이면 계속 관찰하십시오. 임신 32^일 째 아침에 출산이 안 되면 근육에 옥시토신 10단위를 주사하여 진통을 유도합니다.
      참고: 일반적으로 옥시토신을 사용하면 어려운 노동을 해결할 수 있습니다. 일반적으로 옥시토신 주사 후 5-10분 후에 임신한 토끼가 분만을 시작합니다. 옥시토신은 약 30분 동안 효과적이며 30분 후에 다시 투여할 수 있습니다. 옥시토신으로 3회 이상 분만을 유도하는 것은 권장하지 않습니다. 옥시토신이 효과가 없다면 수의사에게 제왕절개 수술을 의뢰한다. 그렇지 않으면 태아가 자궁에서 죽고 부드러워지며 질에서 배출됩니다.

4. 조산사

1. 인큐베이터를 배치하고 준비합니다(그림 1).
   참고: 토끼가 출산하기 전에 미리 준비하십시오. 이 연구에 사용된 인큐베이터의 크기는 길이 45cm× 30cm × 너비 × 높이가 15cm×.
   1. 멸균 흡수성 패딩을 추가합니다. 옥수수 속대 과립을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 수건을 인조 다운 코튼으로 덮인 매트로 펼칩니다.
      참고: 인공 다운 코튼의 소재는 무독성인 유아용 폴리에스터 섬유입니다. 인공 솜털 면은 갓 태어난 토끼가 따뜻하게 유지하는 데 매우 적합합니다. 그러나 어미 토끼의 둥지를 만드는 데 사용할 수 없거나 위장에 먹힐 수 있습니다.
2. 갓 태어난 토끼의 점액을 수건으로 빠르게 닦으십시오. 그들이 부드럽게 숨을 쉬는지 확인한 다음 인큐베이터에 넣으십시오.
   알림: 갓 태어난 토끼의 호흡이 멈추면 즉시 가슴을 눌러 보조 호흡(25-35회/분)을 하여 자발 호흡이 회복될 때까지 가슴 직경을 25%-30% 줄입니다.
3. 임신한 토끼를 낳은 후 태어난 태아의 수를 세십시오. 인큐베이터에 정보 카드를 붙이십시오 : 변형 된 유전자, 갓 태어난 토끼 수, 생년월일 등
   참고: 갓 태어난 토끼에게 적합한 환경 온도는 30-32 °C입니다. 인큐베이터 내부에 적당량의 토끼 털이나 인공 솜털을 넣으면 좋은 단열 효과를 얻을 수 있습니다. 토끼 집은 16-25 °C에서 유지해야합니다. 암컷 토끼는 보통 6-8개의 젖꼭지를 가지고 있습니다. 새끼가 너무 많으면 일부 새끼는 다른 어미 토끼가 먹일 수 있습니다.

5. 산후 관리

1. 아기 토끼 돌보기(그림 2)
   참고: 출산 후에는 모유 수유 전에 어미 토끼를 약 1시간 동안 쉬게 하십시오. 토끼는 보통 하루에 1-3번 모유 수유를 합니다.
   1. 첫 먹이를 주기 전에 어미 토끼의 모든 젖꼭지를 알코올 솜으로 청소하십시오. 모유 수유를 제외하고는 다른 시간에는 어미 토끼와 새끼 토끼를 따로 키운다.
   2. 각 젖꼭지를 부드럽게 마사지하고 첫 번째 우유 한 방울을 부드럽게 짜냅니다.
   3. 생후 1-2일 된 새끼 토끼 먹이주기: 매번 어미 토끼를 옆으로 눕히거나 엎드린 자세로 매트 위에 눕히고 빠는 토끼를 한 마리씩 젖꼭지에 올려 젖을 빨아줍니다(그림 2A). 생후 1-2일 된 토끼는 하루에 2-3번 먹이를 주어야 합니다.
      참고: 조산토끼 또는 저체중 출생 아기 토끼는 저혈당증에 걸리기 쉽습니다. 5% 포도당 1mL를 먹이고 가능한 한 빨리 모유를 섭취하십시오. 아기 토끼가 너무 약해서 물을 마실 수 없으면 5% 포도당 1mL를 복강에 직접 주사합니다.
   4. 생후 2일째에는 마커 펜을 사용하여 각 아기 토끼의 등에 번호를 매깁니다. 유전형 분석을 위해 소량의 꼬리 조직을 다듬습니다.
   5. 생후 2일 이상 된 아기 토끼에게 먹이기: 먹이를 줄 때는 어미 토끼를 인큐베이터에 넣고 스스로 모유수유를 하게 합니다(그림 2B). 생후 2-9일 토끼는 하루에 1-2회, 생후 9일 이상 된 토끼는 젖을 뗄 때까지 하루에 한 번 먹이를 주어야 합니다. 아기 토끼가 가득 찼는지 확인하십시오(그림 2C).
      참고: 어미 토끼가 모유 수유를 꺼리면 신선한 야채를 먹여 더 기꺼이 협력할 수 있습니다. 필요한 경우 어미 토끼를 안정된 위치에 놓은 후 모유를 먹을 수 있습니다. 어미 토끼의 각 젖꼭지에서 첫 번째 우유 한 방울을 부드럽게 짜내어 유방 부종과 통증을 완화하면 아기 토끼가 우유를 빨 수 있습니다. 위의 방법이 효과가 없다면 다른 수유 어미 토끼를 사용하여 모유 수유를 해야 합니다.
   6. 생후 4일 동안은 하루에 두 번 젖은 솜뭉치로 아기 토끼의 회음부를 청소하여 태변과 소변의 배설을 자극합니다(그림 2D).
   7. 아기 토끼의 털이 자라면서 매일 인큐베이터에서 솜털을 제거하십시오.
   8. 아기 토끼가 온몸이 털로 덮일 정도로 자랄 때까지 하루에 한 번 수건을 갈아줍니다.
      참고: 일반적으로 수건은 출생 후 8^일 째가 되면 더 이상 필요하지 않습니다.
   9. 아기 토끼(생후 1-2주)가 설사를 하면 즉시 동물성 겐타마이신(농도 0.04g/mL) 3방울을 하루 2회 연속 5일 동안 먹이십시오.
      참고: 새끼 토끼의 설사는 일반적으로 유선염이 있는 어미 토끼의 우유를 빨거나 환경의 높은 온도와 습도로 인해 발생합니다. 설사를 하는 새끼 토끼의 사망률은 매우 높습니다.
   10. 어린 토끼가 눈을 뜬 후(생후 약 2주) 수건을 깔고 수유 케이지로 옮깁니다. 녹색 사료와 일일 식단을 추가하십시오.
       참고: 아기 토끼(2-3주령)에게 적합한 온도는 23-30 °C입니다.
   11. 어미 토끼와 새끼 토끼를 분리하고 모유 수유를 위해 하루에 한 번만 배플을 엽니다.
       참고: 이렇게 하면 아기 토끼가 어미 토끼의 젖꼭지를 무는 것을 방지할 수 있습니다.
2. 어미 토끼의 산후 관리
   1. 수유 중에는 어미 토끼가 자유롭게 먹고 마실 수 있도록 하고 적절한 녹색 사료를 먹여 적절한 영양을 공급하십시오.
   2. 어미 토끼가 유방염을 앓고 있다면 즉시 모유 수유를 중단하고 치료를 위해 적절한 수의학 항생제를 투여하십시오(세팔로스포린 권장). 어린 토끼를 비슷한 출산 시간을 가진 다른 수유 어미 토끼에게 먹이십시오.

6. 절제

1. 대부분의 어린 토끼는 생후 35일에 젖을 떼도록 합니다. 약한 토끼는 생후 40일에 젖을 뗍니다.
   참고: 어린 토끼(3주에서 3개월)에게 적합한 온도는 20-25°C입니다. 어린 토끼(3-6개월)와 성체 토끼에게 적합한 온도도 15-25°C입니다.
2. 이유식 후 실험 요구 사항에 따라 기존 백신에 대한 예방 접종 여부를 고려합니다.

결과

이 기사는 배아 이식 및 유전자 변형 토끼의 임신 및 수유 관리 절차에 대해 설명합니다. 2022년 말, 저자의 연구실은 유전자 변형 토끼를 위한 준비 플랫폼 개발을 시작했습니다. 이 기간 동안 낙태, 출산 실패, 난산, 출산 전 둥지 준비를 위해 털을 뽑지 않는 것, 어미 토끼가 모유 수유를 꺼리거나 식인 풍습이 발생하는 경우, 큰 배설물로 인한 모유 부족, 아기 토끼가 우유...

토론

배아 이식 및 유전자 변형 토끼의 임신 및 수유 관리의 주요 단계에는 산파술과 조기 모유 수유가 포함됩니다. 어려운 출산은 토끼에서 흔한 문제이다¹⁹. 분만 시간이 길어지면 태아 허혈, 저산소증, 사망이 발생하는 경우가 많다²⁵. 옥시토신을 적절히 사용하면 출산 시간을 효과적으로 단축하고 태아 난산을 줄일 수 있다^26...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290