Manejo da Gravidez e Amamentação para Coelhos Transferidos com Embriões e Geneticamente Modificados

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica de gerenciamento de gravidez e alimentação para coelhos transferidos por embriões e geneticamente modificados, com o objetivo de reduzir a mortalidade de coelhos recém-nascidos e aumentar a eficiência de preparação de coelhos editados por genes.

Resumo

Com o avanço da pesquisa científica, a demanda por modelos de coelhos editados por genes está aumentando. No entanto, existem sistemas limitados de gerenciamento de gravidez e alimentação para coelhos editados por genes, levando a baixas taxas de sobrevivência entre coelhos editados por genes preparados por muitos pesquisadores inexperientes. Portanto, a orientação adequada é essencial. Este artigo resume as práticas de gravidez e alimentação de coelhos geneticamente modificados desenvolvidas no laboratório do autor e descreve um conjunto de processos fundamentais. Isso inclui diagnóstico de gravidez, cuidados pré-natais, obstetrícia, amamentação assistida, desmame e outros procedimentos, juntamente com o resgate e cuidado de coelhos recém-nascidos fracos. Em comparação com os métodos tradicionais de parto natural e nutrição usados em fazendas de coelhos, essa abordagem envolve um manejo mais refinado, exigindo tempo e esforço adicionais, mas aumentando significativamente a taxa de sobrevivência dos coelhos lactentes. Os métodos descritos neste artigo são adequados para a maioria dos cenários de reprodução em laboratório envolvendo coelhos editados por genes ou transferidos por embriões e fornecem uma referência direta e eficaz para outros pesquisadores.

Introdução

Os coelhos são um modelo animal clássico para pesquisa biomédica e estão se tornando cada vez mais o modelo translacional preferido para preencher a lacuna entre modelos de roedores e modelos de animais de grande^{porte 1,2}. Em comparação com animais grandes, os coelhos têm tamanho corporal moderado, pequeno espaço de alimentação, baixo custo de alimentação e coleta de sangue conveniente, o que favorece a coleta repetida de dados de pesquisa e operações cirúrgicas. Os coelhos são caracterizados por boa capacidade reprodutiva, um curto período de gestação (28-32 dias para coelhos brancos da Nova Zelândia), um grande número de nascimentos e crescimento rápido ^3,4. Em comparação com os roedores, os coelhos estão mais próximos dos humanos na filogênese⁵. É um substituto experimental prático e econômico para porcos e primatas não humanos⁶. Em comparação com outros animais de edição de genes de grande e médio porte (porcos, gado, ovelhas, gatos, cães, macacos), o custo de preparação de coelhos de edição de genes é baixo e o ciclo é curto. Com o desenvolvimento da terapia gênica ^7,8,9, terapia com células-tronco 10,11,12,13, pesquisa em ciências do cérebro¹⁴ e outros campos científicos ^{1,15,16,17,18}, a demanda por espécies não roedoras na edição de genes está aumentando.

Os coelhos de edição de genes já foram considerados um dos animais de edição de genes de tamanho médio que poderiam realizar aplicações industriais⁶. No entanto, até hoje, os coelhos editores de genes não conseguiram atingir a produção em larga escala. Uma das principais razões é que a produção e a criação de coelhos com edição de genes são desafiadoras, e a dificuldade é muito maior do que a de camundongos ou ratos com edição de genes. Não há muitos laboratórios que possam cultivar coelhos com edição de genes com eficiência. Muitas vezes é difícil para os iniciantes preparar com sucesso coelhos de edição de genes, e eles freqüentemente encontram problemas desagradáveis como baixa taxa de gravidez¹⁹, aborto²⁰, distocia²¹, recusa de lactação por coelhos fêmeas²² e morte de coelhos lactentes²³. No entanto, existem poucos dados sistemáticos ou diretrizes da literatura sobre a gravidez e alimentação de coelhos editores de genes ou coelhos transferidos de embriões. A maioria deles é baseada na experiência de fazendas de coelhos comuns.

Portanto, este artigo resume a experiência madura de gravidez e manejo de amamentação de coelhos geneticamente modificados do laboratório do autor e apresenta um conjunto de processos básicos de coelhos transferidos por embriões e coelhos geneticamente modificados, incluindo diagnóstico de gravidez, cuidados pré-natais, obstetrícia, alimentação artificial assistida, alactação, bem como o resgate e amamentação de coelhos bebês fracos. Este processo é especialmente estabelecido para a criação de coelhos editores de genes ou coelhos transferidos de embriões. Comparado com o parto natural tradicional e o método de nutrição das fazendas de coelhos, o modelo de gerenciamento de gravidez e amamentação leva mais tempo e energia, mas pode reduzir bastante a mortalidade de coelhos bebês, e o esforço vale a pena.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética para Experimentos em Animais do Centro Animal do Laboratório Médico de Guangdong. O número de revisão ética para a criação de coelhos modificados pelo gene MKRN3 envolvidos neste estudo é B202210-6. O estudo segue procedimentos em conformidade com os padrões éticos descritos na Declaração de Helsinque de 1975 (revisada em 1983). Os coelhos da Nova Zelândia usados neste estudo foram obtidos no Guangdong Medical Laboratory Animal Center, na China. O processo de gravidez e alimentação de coelhos geneticamente modificados descrito neste artigo é um resumo das práticas diárias de criação de animais no laboratório do autor. Detalhes sobre os reagentes e o equipamento usado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Diagnóstico de gravidez

1. Do^12º ao^14º dia após a transferência do embrião (escolha um dos momentos), confirme a gravidez por meio da palpação direta.
   NOTA: Esta etapa pode ser ignorada. Se a palpação for muito áspera e forte, pode levar ao aborto espontâneo em coelhas grávidas.
   1. Segure a pele do pescoço atrás das orelhas do coelho com uma mão, deixe as nádegas do coelho encolherem para a frente, perto da cavidade abdominal das nádegas do coelho e, em seguida, use a outra mão para abrir a palma da mão e palpar suavemente a parte de trás do abdômen.
   2. Pressione o abdômen até certo ponto. Se um fio contínuo de bolas de carne lisas e elásticas, semelhantes em tamanho às favas, for palpado, é considerado gravidez²⁴.
2. Se as condições permitirem, use ultrassom no^15º dia após a transferência do embrião para determinar se a coelha está grávida. O diagnóstico de gravidez de coelhos é baseado na presença de pequenos e fortes pontos ecogênicos (sacos gestacionais) na zona escura do líquido.
3. Durante o período do 16º^ao 18º^{dia após} a transferência do embrião, observe o coelho duas vezes ao dia de manhã e à noite, por aproximadamente 15 minutos de cada vez. Se for observado que o coelho exibe comportamentos como inquietação, respiração rápida, arrancar o cabelo para construir ninhos, etc., durante o trabalho de parto ou estro, isso indica que a coelha está pseudográvida e não concebeu verdadeiramente.
   NOTA: Se a transferência de embriões falhar, as coelhas terão pseudogravidez semelhante à parturiente ou estro no 16º^ao 18º^{dia devido} à diminuição do hormônio lúteo.

2. Cuidados pré-natais

1. Permita que as coelhas grávidas comam livremente durante a gravidez e adicione ração verde fresca uma vez por semana.
2. Na manhã ou noite do^25º dia após a transferência do embrião, transfira as coelhas prenhes para a gaiola de parto.
   1. Desinfete a gaiola de parto, incubadora de animais, pedaços de papel ou aparas com antecedência.
      NOTA: Escolha uma gaiola de entrega para coelhos que atenda aos critérios internacionais de tamanho. Certifique-se de que a gaiola de parto tenha espaço suficiente para a coelha se mover. Escolha uma incubadora que resista à mordidela da mãe coelha. Escolha pedaços de papel grossos com boa absorção de água. De acordo com os requisitos e sugestões da gestão local das instalações para animais, selecione os métodos de desinfecção apropriados.
   2. Fixe a incubadora em um lado da gaiola de parto e coloque toalhas, aparas ou pedaços de papel na incubadora de animais para que as coelhas grávidas façam um ninho.
   3. Forneça ração e água potável adequadas.
   4. Mova suavemente as coelhas grávidas para a gaiola de parto.
   5. Preste atenção se as coelhas grávidas fizeram um ninho na incubadora todos os dias. Caso contrário, adicione alguns pedaços de papel e toalhas fora da incubadora na manhã do^28º dia de gravidez.
      NOTA: Se as coelhas grávidas não fizerem ninhos na incubadora, provavelmente não darão à luz na incubadora. Coloque algumas toalhas e pedaços de papel fora da incubadora para evitar que os coelhos recém-nascidos percam temperatura e morram fora da caixa.

3. Parto

NOTA: O dia 0 refere-se a logo após a fertilização e a formação procariótica. Os coelhos são animais estimuladores da ovulação que ovulam 10-12 h após o acasalamento. Os embriões unicelulares obtidos no dia seguinte ao acasalamento são considerados no^0,5º dia. Se embriões de célula única forem cultivados in vitro por apenas 2-3 h e depois transferidos para coelhos substitutos, também é considerado o 0,5º dia de gravidez.

1. Acompanhamento pré-natal
   NOTA: O período de gestação dos coelhos é de 28-32 dias. Se uma coelha der à luz antes do 30º^{dia de} gravidez, o tamanho do feto geralmente é relativamente pequeno e há casos raros de trabalho de parto difícil. Nenhuma intervenção excessiva é necessária antes do^30º dia.
   1. Na manhã do^30º dia de gravidez em coelhos, faça a palpação abdominal para determinar aproximadamente o número, tamanho e atividade do feto.
      1. Segure a pele do pescoço atrás das orelhas do coelho com uma mão, deixe as nádegas do coelho encolherem para a frente, perto da cavidade abdominal das nádegas do coelho e, em seguida, use a outra mão para abrir a palma da mão e palpar suavemente a parte de trás do abdômen. A força deve ser leve.
         NOTA: Pressionar o abdômen até certo ponto palpará vários elipsóides do tamanho de um ovo, que podem sentir o movimento do feto.
   2. Se for constatado que o número de fetos concebidos por coelhas prenhes é de apenas 1-2, no^30º dia de gravidez, injete 0,02 mg de cloprostenol por via intramuscular às 17h para induzir o parto das coelhas no dia seguinte.
      NOTA: Coelhas grávidas têm apenas 1-2 fetos, que são propensos a distocia ou falha no parto quando maduros.
2. Apressar o parto
   NOTA: Se a coelha grávida não der à luz na manhã do 31º^{dia de} gravidez, pode considerar se precisa acelerar o parto de acordo com as seguintes condições. Se houver mais de 2 fetos, nenhuma ação adicional será tomada.
   1. Se a coelha grávida estiver grávida de apenas 1-2 fetos e tiver sido injetada com cloprostenol no dia anterior, na manhã do 31º^{dia de} gravidez, injete 10 unidades de ocitocina nos músculos para induzir o parto.
   2. Se a coelha grávida apresentar sinais de parto (como inquietação, respiração rápida, dilatação vascular da orelha, arrancar e fazer um ninho, planejar o terreno, etc.), injete 10 unidades de ocitocina nos músculos para induzir o parto.
   3. Se a coelha grávida não apresentar sinais de parto e o movimento fetal for normal, continue a observar. Se não houver parto na manhã do^32º dia de gravidez, injete 10 unidades de ocitocina nos músculos para induzir o parto.
      NOTA: Normalmente, o uso de ocitocina pode resolver o trabalho de parto difícil. Geralmente, 5-10 min após a injeção de ocitocina, as coelhas grávidas iniciam o parto. A ocitocina é eficaz por cerca de meia hora e pode ser administrada novamente após meia hora. Não é recomendado induzir o parto com ocitocina mais de 3 vezes. Se a ocitocina for ineficaz, peça a um veterinário que realize uma cesariana. Caso contrário, o feto morrerá no útero, amolecerá e será liberado da vagina.

4. Obstetrícia

1. Organize e prepare as incubadoras (Figura 1).
   NOTA: Prepare-se com antecedência antes que o coelho dê à luz. O tamanho da incubadora utilizada neste estudo é de 45 cm × 30 cm × 15 cm de comprimento × largura × altura.
   1. Adicione acolchoamento absorvente estéril. Grânulos de espiga de milho são recomendados.
   2. Estenda uma toalha como um tapete coberto com algodão artificial.
      NOTA: O material do algodão artificial é fibra de poliéster de grau infantil, que não é tóxica. O algodão artificial é muito adequado para coelhos recém-nascidos que se mantêm aquecidos. No entanto, não pode ser usado para fazer um ninho para a mãe coelha, ou pode ser comido no estômago.
2. Limpe rapidamente o muco dos coelhos recém-nascidos com uma toalha. Certifique-se de que eles respirem suavemente e, em seguida, coloque-os na incubadora.
   NOTA: Se a respiração de coelhos recém-nascidos parar, pressione imediatamente o peito para respiração auxiliar (25-35 vezes/min) para reduzir o diâmetro do tórax em 25%-30% até que a respiração espontânea seja restaurada.
3. Após o parto de coelhas prenhes, conte o número de fetos nascidos. Cole cartões informativos na incubadora: genes modificados, número de coelhos recém-nascidos, data de nascimento, etc.
   NOTA: A temperatura ambiente adequada para coelhos recém-nascidos é de 30-32 °C. Colocar uma quantidade adequada de pêlo de coelho ou algodão artificial dentro da incubadora pode obter um bom efeito de isolamento. O galpão para coelhos deve ser mantido a 16-25 °C. As coelhas geralmente têm de 6 a 8 mamilos. Se houver muitos bebês, alguns bebês podem ser alimentados por outras coelhas.

5. Cuidados pós-parto

1. Cuidados com o coelho bebê (Figura 2)
   NOTA: Após o parto, deixe a coelha descansar por cerca de 1 h antes de amamentar. Os coelhos geralmente amamentam 1-3 vezes ao dia.
   1. Limpe todos os mamilos da coelha com álcool algodão antes da primeira mamada. Exceto para a amamentação, mantenha as coelhas mães e os coelhos bebês separadamente em outros momentos.
   2. Massageie suavemente cada mamilo e esprema suavemente a primeira gota de leite.
   3. Alimentação de coelhos bebês de 1-2 dias de idade: A cada vez, coloque a coelha mãe no tapete em posição lateral ou de bruços e coloque os coelhos sugadores um a um em seus mamilos para sugar o leite (Figura 2A). Coelhos de 1 a 2 dias precisam ser alimentados 2 a 3 vezes ao dia.
      NOTA: Coelhos prematuros ou coelhos bebês com baixo peso ao nascer são propensos à hipoglicemia. Alimente 1 mL de glicose a 5% e consuma leite materno o mais rápido possível. Se o coelho bebê estiver muito fraco para beber, injete diretamente 1 mL de glicose a 5% na cavidade abdominal.
   4. No segundo dia após o nascimento, use uma caneta marcadora para numerar as costas de cada coelho bebê. Apare uma pequena quantidade de tecido da cauda para genotipagem.
   5. Alimentação de coelhos bebês com mais de 2 dias de idade: Ao alimentar, coloque a coelha mãe em uma incubadora e deixe-a amamentar sozinha (Figura 2B). Coelhos de 2 a 9 dias precisam ser alimentados 1 a 2 vezes ao dia, e coelhos com mais de 9 dias precisam ser alimentados uma vez ao dia até o desmame. Certifique-se de que os coelhos estejam cheios (Figura 2C).
      NOTA: Se a coelha não estiver disposta a amamentar, ela pode ser alimentada com alguns vegetais frescos para torná-la mais disposta a cooperar. Se necessário, as coelhas mães podem ser amamentadas após serem colocadas em uma posição estável. Esprema suavemente a primeira gota de leite de cada mamilo da coelha para aliviar o inchaço e a dor nos seios, o que é benéfico para os coelhos bebês sugarem o leite. Se os métodos acima forem ineficazes, outras coelhas mães lactantes devem ser usadas para amamentar.
   6. Durante os primeiros 4 dias após o nascimento, limpe o períneo do coelho bebê duas vezes ao dia com bolas de algodão molhadas para estimular a excreção de mecônio e urina (Figura 2D).
   7. À medida que o cabelo do coelhinho cresce, remova um pouco de algodão da incubadora todos os dias.
   8. Troque a toalha uma vez por dia até que o coelhinho cresça a ponto de todo o seu corpo ficar coberto de pelos.
      NOTA: Geralmente, a toalha não é mais necessária no^8º dia após o nascimento.
   9. Se coelhos bebês (1-2 semanas de idade) apresentarem diarreia, alimente imediatamente 3 gotas de gentamicina de qualidade animal (concentração de 0,04 g/mL) duas vezes ao dia por 5 dias consecutivos.
      NOTA: A diarreia em coelhos bebês geralmente é causada pela sucção do leite de coelhas mães com mastite ou pela alta temperatura e umidade do ambiente. A taxa de mortalidade de coelhos bebês com diarreia é muito alta.
   10. Depois que o coelho abrir os olhos (cerca de 2 semanas de idade), mova-o para uma gaiola de amamentação com uma toalha. Adicione um pouco de ração verde e dieta diária.
       NOTA: A temperatura adequada para coelhos bebês (2-3 semanas de idade) é de 23-30 °C.
   11. Separe a coelha mãe dos coelhos bebês e abra o defletor apenas uma vez por dia para amamentar.
       NOTA: Isso pode impedir que os coelhos bebês mordam o mamilo da mãe coelha.
2. Cuidados pós-parto da mãe coelha
   1. Durante a lactação, permita que as coelhas bebam e comam livremente e alimente-as com ração verde apropriada para garantir uma nutrição adequada.
   2. Se a coelha sofrer de mastite, pare de amamentar imediatamente e administre antibióticos veterinários apropriados para o tratamento (cefalosporinas são recomendadas). Alimente os coelhos jovens com outras coelhas mães lactantes com prazos de entrega semelhantes.

6. Ablactação

1. Certifique-se de que a maioria dos coelhos jovens seja desmamada aos 35 dias de idade. Coelhos fracos são desmamados aos 40 dias de idade.
   NOTA: A temperatura adequada para coelhos jovens (3 semanas a 3 meses de idade) é de 20-25 °C. A temperatura adequada para coelhos jovens (3-6 meses de idade) e coelhos adultos também é de 15-25 °C.
2. Considere se deve vacinar as vacinas convencionais de acordo com os requisitos experimentais após o desmame.

Resultados

Este artigo descreve um procedimento de manejo da gestação e da alimentação de coelhos transferidos por embriões e geneticamente modificados. No final de 2022, o laboratório do autor iniciou o desenvolvimento de uma plataforma de preparação para coelhos geneticamente modificados. Durante este período, vários problemas comuns foram encontrados, incluindo aborto, falha no parto a termo, distocia, falha em arrancar o cabelo para a preparação do ninho antes do parto, relutância ...

Discussão

As principais etapas no manejo da gravidez e amamentação de coelhos transferidos por embriões e geneticamente modificados incluem obstetrícia e amamentação assistida precoce. O parto difícil é um problema comum em coelhos¹⁹. Tempos de parto prolongados geralmente resultam em isquemia, hipóxia e morte fetal²⁵. O uso adequado de ocitocina pode efetivamente encurtar os tempos de parto e reduzir os casos de distocia fetal

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290