Gestione della gravidanza e dell'allattamento per conigli trasferiti in embrioni e geneticamente modificati

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica di gestione della gravidanza e dell'alimentazione per conigli trasferiti in embrioni e geneticamente modificati, volta a ridurre la mortalità dei conigli appena nati e a migliorare l'efficienza della preparazione dei conigli geneticamente modificati.

Abstract

Con il progresso della ricerca scientifica, la domanda di modelli di coniglio geneticamente modificati è in aumento. Tuttavia, ci sono limitati sistemi di gestione della gravidanza e dell'alimentazione per i conigli geneticamente modificati, che portano a bassi tassi di sopravvivenza tra i conigli geneticamente modificati preparati da molti ricercatori inesperti. Pertanto, una guida adeguata è essenziale. Questo articolo riassume le pratiche di gravidanza e alimentazione per conigli geneticamente modificati sviluppate nel laboratorio dell'autore e delinea una serie di processi fondamentali. Questi includono la diagnosi di gravidanza, l'assistenza prenatale, l'ostetricia, l'allattamento al seno assistito, lo svezzamento e altre procedure, insieme al salvataggio e alla cura di conigli appena nati deboli. Rispetto ai tradizionali metodi naturali di parto e nutrimento utilizzati negli allevamenti di conigli, questo approccio comporta una gestione più raffinata, che richiede tempo e sforzi aggiuntivi ma aumenta significativamente il tasso di sopravvivenza dei conigli da latte. I metodi descritti in questo articolo sono adatti per la maggior parte degli scenari di allevamento di laboratorio che coinvolgono conigli geneticamente modificati o trasferiti in embrioni e forniscono un riferimento diretto ed efficace per altri ricercatori.

Introduzione

I conigli sono un classico modello animale per la ricerca biomedica e stanno diventando sempre più il modello traslazionale preferito per colmare il divario tra i modelli di roditori e i modelli di grandi animali ^1,2. Rispetto agli animali di grandi dimensioni, i conigli hanno dimensioni corporee moderate, spazio di alimentazione ridotto, bassi costi di alimentazione e una comoda raccolta del sangue, che favoriscono la raccolta ripetuta di dati di ricerca e operazioni chirurgiche. I conigli sono caratterizzati da una buona capacità riproduttiva, un breve periodo di gestazione (28-32 giorni per i conigli bianchi della Nuova Zelanda), un gran numero di nascite e una crescita rapida ^3,4. Rispetto ai roditori, i conigli sono più vicini agli esseri umani nella filogenesi⁵. Si tratta di un sostituto sperimentale pratico ed economico per i suini e i primati non umani⁶. Rispetto ad altri animali di editing genetico di grandi e medie dimensioni (maiali, bovini, ovini, gatti, cani, scimmie), il costo di preparazione dei conigli di editing genetico è basso e il ciclo è breve. Con lo sviluppo della terapia genica ^7,8,9, della terapia con cellule staminali 10,11,12,13, della ricerca sulle scienze del cervello¹⁴ e di altri campi scientifici 1,15,16,17,18, la domanda di specie non roditrici nell'editing genetico è in aumento.

I conigli di editing genetico erano un tempo considerati uno degli animali di editing genetico di medie dimensioni in grado di realizzare applicazioni industriali⁶. Tuttavia, fino ad oggi, i conigli che modificano geneticamente non sono stati in grado di raggiungere una produzione su larga scala. Uno dei motivi principali è che la produzione e l'allevamento di conigli con editing genetico sono impegnativi e la difficoltà è molto maggiore rispetto a quella dei topi o dei ratti con editing genetico. Non ci sono molti laboratori in grado di coltivare in modo efficiente conigli con editing genetico. Spesso è difficile per i principianti preparare con successo i conigli con editing genetico e spesso incontrano problemi spiacevoli come il basso tasso di gravidanza¹⁹, l'aborto²⁰, la distocia²¹, il rifiuto dell'allattamento da parte delle coniglie femmine²² e la morte dei conigli da latte²³. Tuttavia, ci sono pochi dati sistematici o linee guida in letteratura sulla gravidanza e l'alimentazione dei conigli con editing genetico o dei conigli trasferiti in embrioni. La maggior parte di essi si basa sull'esperienza di normali allevamenti di conigli.

Pertanto, questo articolo riassume l'esperienza matura della gravidanza e della gestione dell'allattamento di conigli geneticamente modificati dal laboratorio dell'autore e introduce una serie di processi di base di conigli trasferiti in embrioni e conigli geneticamente modificati, tra cui la diagnosi di gravidanza, l'assistenza prenatale, l'ostetricia, l'alimentazione assistita artificiale, l'ablazione, nonché il salvataggio e l'allattamento di coniglietti deboli. Questo processo è stato stabilito appositamente per l'allevamento di conigli con editing genetico o di conigli trasferiti in embrioni. Rispetto al tradizionale metodo naturale di parto e nutrimento degli allevamenti di conigli, il modello di gestione della gravidanza e dell'allattamento richiede più tempo ed energia, ma può ridurre notevolmente la mortalità dei coniglietti e ne vale la pena.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico per gli Esperimenti Animali del Guangdong Medical Laboratory Animal Center. Il numero di revisione etica per l'allevamento di conigli geneticamente modificati MKRN3 coinvolto in questo studio è B202210-6. Lo studio aderisce a procedure conformi agli standard etici delineati nella Dichiarazione di Helsinki del 1975 (rivista nel 1983). I conigli neozelandesi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal Guangdong Medical Laboratory Animal Center in Cina. La gravidanza e il processo di alimentazione dei conigli geneticamente modificati descritti in questo articolo sono un riassunto delle pratiche quotidiane di allevamento degli animali nel laboratorio dell'autore. I dettagli sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Diagnosi di gravidanza

1. Dal 12^{° al} 14^° giorno dopo il trasferimento dell'embrione (scegliere uno dei punti temporali), confermare la gravidanza attraverso la palpazione diretta.
   NOTA: Questo passaggio può essere saltato. Se la palpazione è troppo ruvida e forte, può portare all'aborto spontaneo nelle coniglie gravide.
   1. Tieni la pelle del collo dietro le orecchie del coniglio con una mano, lascia che le natiche del coniglio si restringano in avanti, vicino alla cavità addominale delle natiche del coniglio, quindi usa l'altra mano per aprire il palmo e palpare delicatamente l'estremità posteriore dell'addome.
   2. Premere l'addome in una certa misura. Se viene palpata una serie continua di polpette lisce ed elastiche, di dimensioni simili alle fave, si parla di gravidanza²⁴.
2. Se le condizioni lo consentono, utilizzare l'ecografia il 15^° giorno dopo il trasferimento dell'embrione per determinare se la coniglia è incinta. La diagnosi di gravidanza dei conigli si basa sulla presenza di piccoli e forti punti ecogeni (sacche gestazionali) nella zona scura liquida.
3. Durante il periodo dal 16^{° al} 18^{° giorno dopo} il trasferimento dell'embrione, osservare il coniglio due volte al giorno al mattino e alla sera, per circa 15 minuti ogni volta. Se si osserva che il coniglio mostra comportamenti come irrequietezza, respirazione rapida, strappare i capelli per costruire nidi, ecc., durante il travaglio o l'estro, indica che la coniglietta è pseudoincinta e non ha veramente concepito.
   NOTA: Se il trasferimento dell'embrione fallisce, le femmine di coniglio avranno una pseudogravidanza simile al parto o al calore tra il 16^{° e il} 18° giorno a causa della diminuzione dell'ormone luteale.

2. Cure prenatali

1. Consenti alle coniglie gravide di mangiare liberamente durante la gravidanza e aggiungi mangime verde fresco una volta alla settimana.
2. La mattina o la sera del 25^° giorno dopo il trasferimento dell'embrione, trasferire le coniglie gravide nella gabbia del parto.
   1. Disinfettare in anticipo la gabbia di parto, l'incubatrice, gli avanzi di carta o i trucioli.
      NOTA: Scegli una gabbia per il parto dei conigli che soddisfi i criteri internazionali in termini di dimensioni. Assicurarsi che la gabbia per il parto abbia spazio sufficiente per consentire alla mamma coniglio di muoversi. Scegli un'incubatrice in grado di resistere al mordicchiamento di mamma coniglio. Scegli ritagli di carta spessi con un buon assorbimento d'acqua. In base ai requisiti e ai suggerimenti della gestione locale della struttura per animali, selezionare metodi di disinfezione appropriati.
   2. Fissa l'incubatrice su un lato della gabbia di parto e metti asciugamani, trucioli o ritagli di carta nell'incubatrice per animali affinché le coniglie gravide facciano un nido.
   3. Fornire cibo e acqua potabile adeguati.
   4. Sposta delicatamente le coniglie gravide nella gabbia del parto.
   5. Presta attenzione se le coniglie gravide hanno fatto un nido nell'incubatrice ogni giorno. In caso contrario, aggiungi alcuni ritagli di carta e asciugamani fuori dall'incubatrice la mattina del 28^{° giorno di} gravidanza.
      NOTA: Se le coniglie gravide non nidificano nell'incubatrice, probabilmente non partoriranno nell'incubatrice. Metti degli asciugamani e dei ritagli di carta fuori dall'incubatrice per evitare che i conigli appena nati perdano la temperatura e muoiano fuori dalla scatola.

3. Parto

NOTA: Il giorno 0 si riferisce a poco dopo la fecondazione e la formazione procariotica. I conigli sono animali che stimolano l'ovulazione e ovulano 10-12 ore dopo l'accoppiamento. Gli embrioni allo stadio di singola cellula ottenuti il giorno dopo l'accoppiamento sono considerati allo 0,5^{° giorno.} Se gli embrioni allo stadio di singola cellula vengono coltivati in vitro per sole 2-3 ore e poi trasferiti a conigli surrogati, è anche considerato lo 0,5^{° giorno di} gravidanza.

1. Monitoraggio prenatale
   NOTA: Il periodo di gestazione dei conigli è di 28-32 giorni. Se un coniglio partorisce prima del 30^° giorno di gravidanza, le dimensioni del feto sono solitamente relativamente piccole e ci sono rari casi di travaglio difficile. Non è necessario alcun intervento eccessivo prima del 30^° giorno.
   1. La mattina del 30^° giorno di gravidanza nei conigli, eseguire la palpazione addominale per determinare approssimativamente il numero, le dimensioni e l'attività del feto.
      1. Tieni la pelle del collo dietro le orecchie del coniglio con una mano, lascia che le natiche del coniglio si restringano in avanti, vicino alla cavità addominale delle natiche del coniglio, quindi usa l'altra mano per aprire il palmo e palpare delicatamente l'estremità posteriore dell'addome. La forza deve essere leggera.
         NOTA: Premendo nell'addome in una certa misura si palpano diversi ellissoidi delle dimensioni di un uovo, che possono sentire il movimento del feto.
   2. Se si riscontra che il numero di feti concepiti da conigli gravidi è solo 1-2, il 30^{° giorno di} gravidanza, iniettare 0,02 mg di cloprostenolo per via intramuscolare alle 17:00 per indurre il parto dei conigli il giorno successivo.
      NOTA: Le coniglie gravide hanno solo 1-2 feti, che sono inclini a distocia o fallimento del parto quando sono maturi.
2. Accelera il parto
   NOTA: Se la coniglia gravida non partorisce la mattina del 31^{° giorno di} gravidanza, può valutare se è necessario accelerare il parto in base alle seguenti condizioni. Se ci sono più di 2 feti, non verranno intraprese ulteriori azioni.
   1. Se la coniglietta incinta è incinta solo di 1-2 feti ed è stata iniettata con cloprostenolo il giorno prima, la mattina del 31^° giorno di gravidanza, iniettare 10 unità di ossitocina nei muscoli per indurre il travaglio.
   2. Se la coniglia gravida ha segni di parto (come irrequietezza, respirazione rapida, dilatazione vascolare dell'orecchio, spiumatura e costruzione di un nido, pianificazione del terreno, ecc.), iniettare 10 unità di ossitocina nei muscoli per indurre il travaglio.
   3. Se la coniglia incinta non ha segni di parto e il movimento fetale è normale, continua a osservare. Se non c'è parto la mattina del 32^{° giorno di} gravidanza, iniettare 10 unità di ossitocina nei muscoli per indurre il travaglio.
      NOTA: Di solito, l'uso dell'ossitocina può risolvere un travaglio difficile. Generalmente, 5-10 minuti dopo l'iniezione di ossitocina, le coniglie gravide iniziano il parto. L'ossitocina è efficace per circa mezz'ora e può essere somministrata nuovamente dopo mezz'ora. Non è consigliabile indurre il travaglio con ossitocina più di 3 volte. Se l'ossitocina è inefficace, chiedi a un veterinario di eseguire un taglio cesareo. In caso contrario, il feto morirà nell'utero, si ammorbidirà e verrà dimesso dalla vagina.

4. Ostetricia

1. Disporre e preparare le incubatrici (Figura 1).
   NOTA: Prepararsi in anticipo prima che il coniglio partorisca. La dimensione dell'incubatrice utilizzata in questo studio è di 45 cm × 30 cm × 15 cm di lunghezza × larghezza × altezza.
   1. Aggiungere un'imbottitura assorbente sterile. Si consigliano granuli di pannocchia.
   2. Stendi un asciugamano come un tappetino ricoperto di piumino di cotone artificiale.
      NOTA: Il materiale del cotone in piuma artificiale è una fibra di poliestere per bambini, che non è tossica. Il piumino di cotone artificiale è molto adatto per i conigli appena nati che si tengono al caldo. Tuttavia, non può essere utilizzato per fare un nido per la mamma coniglio, o può essere mangiato nello stomaco.
2. Pulisci rapidamente il muco sui conigli appena nati con un asciugamano. Assicurati che respirino dolcemente, quindi mettili nell'incubatrice.
   NOTA: Se la respirazione dei conigli appena nati si interrompe, premere immediatamente il torace per la respirazione ausiliaria (25-35 volte/min) per ridurre il diametro del torace del 25%-30% fino a ripristinare la respirazione spontanea.
3. Dopo il parto di conigli gravidi, contare il numero di feti nati. Attaccare schede informative sull'incubatrice: geni modificati, numero di conigli appena nati, data di nascita, ecc.
   NOTA: La temperatura ambientale adatta per i conigli appena nati è di 30-32 °C. Posizionare una quantità adeguata di pelo di coniglio o cotone artificiale all'interno dell'incubatrice può ottenere un buon effetto isolante. La casetta dei conigli deve essere mantenuta a 16-25 °C. Le femmine di coniglio di solito hanno 6-8 capezzoli. Se ci sono troppi bambini, alcuni bambini possono essere nutriti da altre madri conigli.

5. Assistenza postpartum

1. Cura dei cuccioli di coniglio (Figura 2)
   NOTA: Dopo il parto, lasciare riposare la mamma coniglia per circa 1 ora prima di allattare. I conigli di solito allattano al seno 1-3 volte al giorno.
   1. Pulisci tutti i capezzoli della mamma coniglio con cotone alcolico prima della prima poppata. Fatta eccezione per l'allattamento al seno, tenere separate le cappe madri e i coniglietti negli altri momenti.
   2. Massaggiare delicatamente ogni capezzolo e spremere delicatamente la prima goccia di latte.
   3. Alimentazione dei coniglietti di 1-2 giorni: ogni volta, posizionare la coniglietta madre sul tappetino in posizione laterale o prona e posizionare i conigli lattatori uno per uno ai capezzoli per succhiare il latte (Figura 2A). I conigli di 1-2 giorni devono essere nutriti 2-3 volte al giorno.
      NOTA: I conigli prematuri o i coniglietti di basso peso alla nascita sono inclini all'ipoglicemia. Somministrare 1 ml di glucosio al 5% e consumare latte materno il prima possibile. Se il coniglietto è troppo debole per bere, iniettare direttamente 1 ml di glucosio al 5% nella cavità addominale.
   4. Il secondo giorno dopo la nascita, usa un pennarello per numerare la schiena di ogni coniglietto. Tagliare una piccola quantità di tessuto della coda per la genotipizzazione.
   5. Alimentazione dei coniglietti di età superiore ai 2 giorni: Durante l'allattamento, posizionare la coniglietta madre in un'incubatrice e lasciarla allattare da sola (Figura 2B). I conigli di 2-9 giorni devono essere nutriti 1-2 volte al giorno e i conigli di età superiore ai 9 giorni devono essere nutriti una volta al giorno fino allo svezzamento. Assicurati che i coniglietti siano pieni (Figura 2C).
      NOTA: Se la mamma coniglio non è disposta ad allattare, può essere nutrita con alcune verdure fresche per renderla più disposta a collaborare. Se necessario, le madri possono essere allattate al seno dopo essere state poste in una posizione stabile. Spremere delicatamente la prima goccia di latte da ogni capezzolo della mamma coniglio per alleviare il gonfiore e il dolore al seno, il che è utile per i coniglietti per succhiare il latte. Se i metodi di cui sopra sono inefficaci, per l'allattamento al seno dovrebbero essere utilizzate altre madri di coniglio in allattamento.
   6. Durante i primi 4 giorni dopo la nascita, pulire il perineo del coniglietto due volte al giorno con batuffoli di cotone bagnati per stimolare l'escrezione di meconio e urina (Figura 2D).
   7. Man mano che il pelo del coniglietto cresce, rimuovi un po' di piumino dall'incubatrice ogni giorno.
   8. Cambia l'asciugamano una volta al giorno fino a quando il coniglietto non cresce fino al punto in cui tutto il suo corpo è coperto di peli.
      NOTA: Generalmente, l'asciugamano non è più necessario l'8^{° giorno dopo} la nascita.
   9. Se i coniglietti (1-2 settimane di età) manifestano diarrea, somministrare immediatamente 3 gocce di gentamicina di grado animale (la concentrazione è di 0,04 g/mL) due volte al giorno per 5 giorni consecutivi.
      NOTA: La diarrea nei coniglietti è solitamente causata dalla suzione del latte da conigli madri con mastite, o dall'alta temperatura e umidità dell'ambiente. Il tasso di mortalità dei coniglietti con diarrea è molto alto.
   10. Dopo che il giovane coniglio ha aperto gli occhi (circa 2 settimane), spostalo in una gabbia per l'allattamento con un asciugamano. Aggiungi un po' di mangime verde e dieta quotidiana.
       NOTA: La temperatura adatta per i coniglietti (2-3 settimane di età) è di 23-30 °C.
   11. Separare la mamma coniglio dai coniglietti e aprire il deflettore solo una volta al giorno per l'allattamento.
       NOTA: Questo può impedire ai coniglietti di mordere il capezzolo della mamma coniglio.
2. Cura postpartum della mamma coniglio
   1. Durante l'allattamento, lasciare che le coniglie madri bevano e mangino liberamente e nutrirle con mangime verde appropriato per garantire un'alimentazione adeguata.
   2. Se la madre coniglio soffre di mastite, interrompere immediatamente l'allattamento al seno e somministrare antibiotici veterinari appropriati per il trattamento (si raccomandano cefalosporine). Dai da mangiare i giovani conigli ad altre madri in allattamento con tempi di consegna simili.

6. Ablattazione

1. Assicurati che la maggior parte dei conigli giovani venga svezzata a 35 giorni di età. I conigli deboli vengono svezzati a 40 giorni di età.
   NOTA: La temperatura adatta per i conigli giovani (da 3 settimane a 3 mesi) è di 20-25 °C. Anche la temperatura adatta per i conigli giovani (3-6 mesi) e i conigli adulti è di 15-25 °C.
2. Valutare se vaccinare i vaccini convenzionali in base ai requisiti sperimentali dopo lo svezzamento.

Risultati

Questo articolo descrive una procedura di gestione della gravidanza e dell'alimentazione per conigli trasferiti in embrioni e geneticamente modificati. Alla fine del 2022, il laboratorio dell'autore ha avviato lo sviluppo di una piattaforma di preparazione per conigli geneticamente modificati. Durante questo periodo, sono stati riscontrati diversi problemi comuni, tra cui l'aborto, il mancato parto a termine, la distocia, l'incapacità di strappare i peli per la preparazione del nido pri...

Discussione

Le fasi principali della gestione della gravidanza e dell'allattamento dei conigli trasferiti in embrioni e geneticamente modificati includono l'ostetricia e l'allattamento al seno assistito precoce. Il parto difficile è un problema comune nei conigli¹⁹. I tempi di parto prolungati spesso provocano ischemia, ipossia e morte fetale²⁵. L'uso appropriato dell'ossitocina può accorciare efficacemente i tempi di parto e ridurre i casi di distoc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial down cotton	Yangzhou Anguang Textile Co., Ltd, China	5490-Jinyu
Cloprostenol Sodium Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology (Zhumadian) Animal Pharmaceutical Co., Ltd, China	163232207
Corncob granules	Guangdong Provincial Medical Laboratory Animal Center, China	YUMIXIN
Electronic platform scale	Yongkang Runjin weighing instrument Co., Ltd, China	rj-09
Gentamicin	Shanxi Jinfukang Biological Pharmaceutical Co., Ltd, China	041531504
Glucose injection	Henan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd, China	H41022251
Incubator	Foshan Chancheng Hualong Plastic Factory, China	AAA-2	For newborn rabbits
Incubator box	Hebei mabao wire mesh products Co., Ltd., China	https://qr.1688.com/s/AJ1K7O3p	As a nest for the mother rabbits
Inslin Syringe	Becton,Dickinson and Company, USA	Ultra-Fine,328421
Oxytocin injection	Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd	H44025245
Penicillin injection	Guangdong Kangtaiyuan Animal Husbandry Co., Ltd, China	300012430
Rabbit delivery cage	Suzhou Suhang Technology Equipment Co., Ltd., Suzhou, China	RB42-8G
Towel	Zhejiang Jieliya Co., Ltd, China	W3290