<p class="jove_content"> Agradecemos Molecular Devices tecnologías analíticas / ™ Arturo por su generosa donación de los reactivos utilizados para el estudio. También agradecemos a los tejidos de Harvard, Centro de Recursos para proporcionar el tejido postmortem del cerebro humano <strong>Financiación:.</strong> RO1MH76060 y P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">The production of this video-article was sponsored by Life Technologies.</p>

<p class="jove_content"> En este caso, se intenta personalizar un protocolo para extraer poblaciones homogéneas de células del tejido cerebral postmortem heterogéneos utilizando el sistema de Arcturus XT ™ y relacionados con los kits de extracción de RNA. Como se mencionó anteriormente, hemos hecho algunas modificaciones en los protocolos originales proporcionados por la empresa, con el fin de maximizar la integridad del ARN. La captura exitosa de células individuales depende exclusivamente de la optimización de los pasos antes de la captura con el fin de lograr la máxima células con ARN buena. Estas etapas incluyen los diversos parámetros asociados con el tejido seccionado y tinción. En resumen, en lo que respecta a la preparación de los tejidos que incluyen: 1) la disminución del gradiente de temperatura en la sección, 2) sólo la colocación de dos secciones por diapositiva, 3) realizar todos los pasos de la deshidratación en el hielo, 4) la adición de inhibidor de RNasa de la mancha 5), ​​el aumento la duración de la deshidratación en la final de etanol al 100% a 3 minutos. </p><p class="jove_content"> En cuanto a la captura, creemos que la combinación de tapas CapSure ™ SA, con el software de configuración de la macro, debe garantizar resultados óptimos. Un ambiente con humedad controlada es fundamental para captar células individuales, como la alta humedad reduce drásticamente el tejido &quot;levantar&quot;. Las altas temperaturas también pueden tener un efecto negativo en la calidad del ARN. </p><p class="jove_content"> Durante el protocolo de aislamiento de ARN con la PicoPure ® kit, hay dos pasos de lavado. Es importante comprobar que todos los tampón de lavado se elimina antes de ser transferido a otro tubo de microcentrífuga de elución de ARN, ya que cualquier presencia de la memoria intermedia en la muestra final se traducirá en menos de ARN de partida para la amplificación. Para asegurar esto, centrifugar la etapa de lavado final de 2,5 minutos en lugar de 2 minutos como se indica en el protocolo previsto. </p><p class="jove_content"> En su mayor parte, el protocolo de amplificación lineal de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Sin embargo, dos puntos cruciales deben ser tenidos en cuenta cuando se utiliza este protocolo: 1) tratar de limitar la pérdida de ARN a través de la transferencia de exceso de muestras entre los tubos, usando solamente los tubos de 0,5 ml suministra junto con un bloque de 0,5 ml en el termociclador y 2) la hora de transferir la muestra a la columna de purificación para la purificación de cDNA, asegúrese de girar los tubos de muestra después de la primera transferencia. Esto se traducirá en un adicional de 1 2UL de ejemplo para agregar a la columna de purificación y por lo tanto, puede aumentar la recuperación de cDNA. </p><p class="jove_content"> Al hacer uso de la TURBO ™ de fin de etiquetado kit de biotina-etiquetado de las muestras ARNA limitado, se sugiere añadir un extra de unos pocos l de agua antes de la etapa de centrifugación, para aumentar el rendimiento de ARN marcado extraído de la columna. Un minuto adicional de la centrifugación también ayudará en este sentido, sobre todo si se trabaja con tejidos degradados, como el tejido FFPE. </p><p class="jove_content"> Estamos seguros de que este protocolo permitirá al usuario para aislar pequeñas estructuras homogéneas, como las poblaciones de células individuales, dentro del tejido cerebral postmortem heterogéneo. Esto reduce los efectos de dilución de las estructuras circundantes y otros tipos de células ubicadas en las diversas capas del cerebro, dando lugar a resultados dirigidos a los tipos de células específicas de investigación. Como la calidad de la resultante de ARN es lo suficientemente bueno para los estudios de microarrays, podemos empezar a identificar firmas moleculares específicas de las poblaciones de células específicas afectadas en los estados de enfermedad. </p>

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Nos propusimos investigar la reducción de materia gris en el gyrus temporal superior se ve en pacientes con esquizofrenia, interrogando a los perfiles de expresión génica de las neuronas piramidales de la capa III. Es bien sabido que la corteza cerebral es una estructura extraordinariamente heterogéneo que comprende las diversas regiones, capas y tipos de células, cada una de ellas se caracteriza por diferentes composiciones moleculares y celulares y por lo tanto, los perfiles de genes de expresión diferencial. Para evitar los efectos de confusión de la heterogeneidad del tejido, que utiliza láser de captura de microdisección (LCM) con el fin de aislar a nuestro tipo específico de células-es decir, las neuronas piramidales. </p><p class="jove_content"> Aproximadamente 500 neuronas piramidales se tiñeron con la solución de tinción HistoGene fueron capturados utilizando el sistema de Arcturus XT LCM. Se aisló el ARN de las células luego capturado y sometido a dos rondas de T7 basada en la amplificación lineal utilizando Arcturus / kits Molecular Devices. El LabChip Experion (Bio-Rad) y gel electroferograma indica la buena calidad de un ARN (m), con una transcripción de longitud se extiende 600nt últimos necesarios para microarrays. La cantidad de ARNm obtenido un promedio de 51μg, con una pureza aceptable media de la muestra, como se indica por la relación A260/280, de 2,5. La expresión génica se perfila con los humanos X3P serie sonda GeneChip de Affymetrix. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Se describe un procedimiento que utiliza láser microdisección de captura para aislar y extraer el ARN de una población celular homogénea, las neuronas piramidales en la capa III de la circunvolución temporal superior en los cerebros humanos postmortem. Estamos posteriormente amplifican linealmente (T7-based) mRNA, y se hibridan la muestra a la Affymetrix humanos X3P microarrays.</p>

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K vistas.  McLean Hospital. Se describe un procedimiento que utiliza láser microdisección de captura para aislar y extraer el ARN de una población celular homogénea, las neuronas piramidales en la capa III de la circunvolución temporal superior en los cerebros humanos postmortem. Estamos posteriormente amplifican linealmente (T7-based) mRNA, y se hibridan la muestra a la Affymetrix humanos X3P microarrays.