<p class="jove_content"> Noi riconosciamo con gratitudine Molecular Devices tecnologie analitiche / Arturo per la loro generosa donazione di reagenti utilizzati per lo studio. Ringraziamo anche il Centro Tissue Harvard risorse per la fornitura di tessuto cerebrale umano autoptico <strong>Finanziamento:.</strong> RO1MH76060 e P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Qui, si cerca di personalizzare un protocollo per estrarre popolazioni di cellule omogenee dal tessuto cerebrale post-mortem eterogenei utilizzando il Arcturus XT sistema e dei relativi kit di estrazione di RNA. Come accennato in precedenza, abbiamo fatto alcune modifiche ai protocolli originali forniti dalla società, al fine di massimizzare l&#39;integrità dell&#39;RNA. La cattura di successo di singole cellule dipende unicamente ottimizzare i passi precedenti per catturare al fine di ottenere cellule massimo con RNA bene. Questi passaggi sono i vari parametri associati con il tessuto sezionamento e colorazione. In breve, per quanto riguarda la preparazione dei tessuti queste includono: 1) diminuire il gradiente termico Durante il taglio, 2) solo ponendo 2 sezioni per vetrino, 3) esecuzione di tutte le misure disidratazione sul ghiaccio, 4) l&#39;aggiunta di inibitore della RNasi alla macchia, 5) l&#39;aumento la durata disidratazione in etanolo finale del 100% a 3 minuti. </p><p class="jove_content"> Per quanto riguarda la cattura, riteniamo che la combinazione di CapSure SA cappellini, con il software di impostazione macro, dovrebbe garantire risultati ottimali. Una umidità controllata ambiente è fondamentale per catturare singole cellule, come alta umidità riduce drasticamente i tessuti &quot;lift&quot;. Le alte temperature possono anche avere un effetto negativo sulla qualità di RNA. </p><p class="jove_content"> Durante il protocollo di isolamento del RNA con il kit PicoPure, ci sono due fasi di lavaggio. E &#39;importante verificare che tutte tampone di lavaggio viene rimosso prima del trasferimento in un&#39;altra provetta per l&#39;eluizione di RNA, come l&#39;eventuale presenza del buffer nel campione finale si tradurrà in meno di RNA di partenza per l&#39;amplificazione. Per garantire ciò, abbiamo centrifuga la fase finale di lavaggio per 2,5 minuti invece di 2 minuti come suggerito nel protocollo fornito. </p><p class="jove_content"> Per la maggior parte, il protocollo di amplificazione lineare è stato secondo le istruzioni del produttore. Tuttavia, due punti cruciali devono essere presi in considerazione quando si utilizzano questo protocollo: 1) cercare di limitare la perdita di RNA attraverso il trasferimento di eccesso di campioni tra i tubi, utilizzando solo i tubi da 0,5 ml fornito in combinazione con un blocco di 0,5 ml nel termociclatore e 2) durante il trasferimento del campione alla colonna di purificazione per la purificazione di cDNA, assicuratevi di girare giù i tubi campione dopo il primo trasferimento. Ciò si tradurrà in un ulteriore 1-2ul di esempio per aggiungere alla colonna di purificazione e quindi può aumentare il recupero di cDNA. </p><p class="jove_content"> Se si avvalgono del TURBO fine di etichettatura kit per la biotina-etichettatura dei vostri campioni ARNA limitato, si consiglia l&#39;aggiunta di un ulteriore pochi microlitri di acqua prima della fase di centrifugazione, per aumentare l&#39;RNA marcato resa estratto dalla colonna. Un minuto in più di centrifugazione aiuterà anche in questo senso, soprattutto se si lavora con il tessuto degradato, come il tessuto FFPE. </p><p class="jove_content"> Siamo certi che questo protocollo permetterà all&#39;utente di isolare piccole strutture omogenee, come le popolazioni singola cella, all&#39;interno del tessuto cerebrale post-mortem eterogenei. Questo riduce gli effetti di diluizione delle strutture circostanti e altri tipi di cellule situate nei vari strati all&#39;interno del cervello, portando a risultati mirati nei confronti dei tipi cellulari specifici sotto inchiesta. Come la qualità del risultato RNA è abbastanza buona per gli studi di microarray, possiamo cominciare a individuare specifiche firme molecolari di popolazioni di cellule specifiche colpite in stati di malattia. </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Abbiamo proposto di indagare la riduzione di materia grigia nella circonvoluzione temporale superiore osservato nei pazienti schizofrenici, interrogando profili di espressione genica dei neuroni piramidali dello strato III. E &#39;noto che la corteccia cerebrale è una struttura estremamente eterogenea composta da diverse regioni, i livelli e tipi di cellule, ognuna delle quali è caratterizzata da diverse composizioni cellulari e molecolari e di conseguenza differenziale profili di espressione genica. Per aggirare gli effetti confondenti di eterogeneità del tessuto, abbiamo usato la cattura microdissezione laser (LCM) al fine di isolare il nostro specifico tipo cellulare cioè neuroni piramidali. </p><p class="jove_content"> Circa 500 neuroni piramidali colorate con la soluzione colorante Histogene sono stati catturati utilizzando il sistema di LCM Arcturus XT. RNA è stato poi isolato dalle cellule catturati e sottoposti a due giri di T7-based amplificazione lineare utilizzando Arturo / molecolare kit Devices. Il LabChip Experion (Bio-Rad) gel e elettroferogramma indicato di qualità ad un (m) RNA, con una lunghezza trascrizione estendere 600nt passato necessari per microarray. La quantità di mRNA ottenuto una media di 51μg, con accettabile purezza media del campione, come indicato dal rapporto A260/280, di 2,5. Espressione genica è stata profilata utilizzando il Umani X3P serie sonda GeneChip da Affymetrix. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Descriviamo un processo che utilizza laser-capture microdissezione per isolare ed estrarre l&#39;RNA da una popolazione omogenea di cellule, neuroni piramidali, nello strato III del giro temporale superiore nel cervello umano post-mortem. Successivamente abbiamo linearmente amplificare (T7-based) mRNA, e ibridare il campione umano X3P microarray Affymetrix.</p>

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Views.  McLean Hospital. Descriviamo un processo che utilizza laser-capture microdissezione per isolare ed estrarre l'RNA da una popolazione omogenea di cellule, neuroni piramidali, nello strato III del giro temporale superiore nel cervello umano post-mortem. Successivamente abbiamo linearmente amplificare (T7-based) mRNA, e ibridare il campione umano X3P microarray Affymetrix.