<p class="jove_content"> Biz minnetle cömert bağışı için çalışma için kullanılan reaktiflerin Moleküler Cihazlar Analitik teknolojileri / Arcturus kabul etmiş oluyorsunuz. Ayrıca Harvard Doku Kaynağı Merkezi postmortem insan beyin dokusu sağlamak için teşekkür <strong>Finansman:</strong> RO1MH76060 ve P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> Bu video-makale üretim Yaşam Teknolojileri tarafından sponsor oldu. </p>

<p class="jove_content"> Burada, Arcturus XT sistemi ve ilgili RNA ekstraksiyon kitleri kullanarak heterojen postmortem beyin dokusu homojen hücre popülasyonlarının ayıklamak için bir protokol özelleştirmek için çalışırlar. Yukarıda belirtildiği gibi, RNA bütünlüğünü maksimize etmek için, şirket tarafından sağlanan orijinal protokollere bazı değişiklikler yaptık. Tek hücre başarılı yakalama sadece iyi RNA ile maksimum hücreleri elde etmek için yakalamak için önceki adımları optimize bağlıdır. Bu adımlar, doku kesit ve boyama ile ilgili çeşitli parametreler içerir. Kısacası, bu doku hazırlanması konusunda şunlardır: 1), 2 kesit sıcaklık gradyanı azalan) sadece 4 dehidrasyon, buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirdikten slayt başına 2 bölüm, 3) yerleştirerek) artan) Leke, 5 RNaz İnhibitörü ekleyerek 3 dakika için son% 100 etanol dehidrasyon süresi. </p><p class="jove_content"> Ilgili yakalama, biz CapSure HS kapaklar, Makro ayarı yazılımı ile kombinasyonu optimum sonuçlar sağlamak gerektiğini hissediyorum. Nem kontrollü bir ortamda, yüksek nem, doku &quot;asansör&quot; önemli ölçüde azaltır olarak yakalayan tek hücre için çok önemlidir. Yüksek sıcaklıklar da RNA kalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. </p><p class="jove_content"> PicoPure kiti ile RNA izolasyonu protokol sırasında, iki yıkama adımlar vardır. Bu RNA yürütülmesi için başka bir mikrosantrifüj tüp aktarmadan önce, tüm yıkama tamponu kaldırıldı olup olmadığını kontrol edin, son örnek tampon herhangi bir varlığı olarak amplifikasyonu için daha az başlangıç ​​RNA neden olacaktır önemlidir. Bunu sağlamak için, verilen protokol önerilen 2.5 dakika yerine 2 dakika için son yıkama adım santrifüj. </p><p class="jove_content"> Doğrusal amplifikasyon protokolü büyük bir kısmı için, üreticinin talimatlarına göre. Ancak, bu protokolü kullanırken iki önemli noktayı dikkate alınması gerekmektedir: 1) borular arasında, sadece termal cycler 0.5 ml bloğu ile birlikte sağlanan 0.5 ml tüpler kullanarak aşırı örneklerin aktarılması yoluyla RNA kaybının deneyin ve 2) için örnek cDNA arıtılması için arıtma sütununa aktarırken, ilk transferinden sonra örnek tüpler aşağı spin emin olun. Bu arıtma sütun eklemek ve bu nedenle cDNA kurtarma artırabilir örnek bir ek 1 2ul neden olacaktır. </p><p class="jove_content"> TURBO son etiketleme kiti kullanımı sınırlı Arna örnekleri biotin-etiketlenmesi için yaparken, ekstra bir kaç ul ekleyerek etiketli RNA sütun çıkarılan verimi artırmak, santrifüj adım önce su öneririz. Santrifüj ekstra bir dakika da FFPE doku gibi bozulmuş doku ile çalışıyoruz, özellikle eğer bu konuda yardımcı olacaktır. </p><p class="jove_content"> Biz bu protokolü, heterojen postmortem beyin dokusu içinde tek bir hücre nüfus, küçük homojen yapılar, izole etmek için kullanıcı sağlayacaktır emin hissediyorum. Bu soruşturma altında özel hücre tipleri doğru hedeflenen sonuçlara yol açan beyin içinde çeşitli katmanlarında bulunan çevreleyen yapılar ve diğer hücre türleri sulandırma etkileri azaltır. Ortaya çıkan RNA kalitesini mikroarray çalışmaları için yeterli olduğu gibi, belirli bir hücre popülasyonlarının hastalık durumlarında etkilenen spesifik moleküler imzaları saptamak için başlayabilir. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Biz tabaka III piramidal nöronların gen ekspresyon profilleri sorgulayarak, şizofreni hastalarında görülen superior temporal girus gri cevherde azalma araştırmak için önerdi. Serebral korteks, farklı bölgelerde, katmanlar ve hücre tipleri, her biri farklı hücresel ve moleküler kompozisyon ve bu nedenle diferansiyel gen ekspresyon profilleri ile karakterize oluşan son derece heterojen bir yapısı olduğu bilinmektedir. Doku heterojenliğin karıştırıcı etkilerini aşmak için, belirli bir hücre tipi yani piramidal nöronlar izole etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanılır. </p><p class="jove_content"> Histogene boyama solüsyonu ile boyanmış yaklaşık 500 piramidal nöronlar Arcturus XT LCM sistemini kullanarak ele geçirildi. RNA daha sonra yakalanan hücreleri izole ve iki tur T7 tabanlı doğrusal amplifikasyon Arcturus / Moleküler Cihazlar kitleri kullanılarak uygulandı. Experion LabChip (Bio-Rad) jel ve Elektroferogram mikroarray&#39;ler için gerekli geçmiş 600nt uzanan bir transkript uzunluğu ile, kaliteli bir (m) RNA belirtilir. 2.5 A260/280 oranı, belirtildiği gibi, elde edilen mRNA miktarı kabul edilebilir ortalama örnek saflıkta, 51μg ortalama. Gen ekspresyonu Affymetrix İnsan X3P GeneChip prob dizi ile profilli oldu. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.</p>

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Görüntüleme.  McLean Hospital. Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.