<p class="jove_content"> Wir bedanken uns für Molecular Devices Analytical Technologien / Arcturus für die großzügige Spende von Reagenzien für die Studie verwendet. Wir danken auch der Harvard Tissue Resource Center für die Bereitstellung von postmortalen menschlichen Hirngewebe <strong>Finanzierung:.</strong> RO1MH76060 und P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von Life Technologies gesponsert. </p>

<p class="jove_content"> Hier versuchen wir, ein Protokoll anzufertigen, um homogene Zellpopulationen aus heterogenen postmortalen Hirngewebe mit dem Arcturus XT-System und verwandte RNA Extraktion Kits zu extrahieren. Wie oben dargelegt, haben wir einige Änderungen an dem ursprünglichen Protokolle, die von dem Unternehmen zur Verfügung gestellt hat, um RNA-Integrität zu maximieren. Die erfolgreiche Erfassung der einzelnen Zellen hängt einzig und allein auf die Optimierung der Schritte vor der Aufnahme um ein Höchstmaß an Zellen mit guter RNA zu erreichen. Diese Schritte umfassen die verschiedenen Parameter mit Gewebe Schneiden und Färben verbunden. Kurz gesagt, in Bezug auf Gewebe Vorbereitung dazu gehören: 1) Verringerung der Temperaturgradienten beim Schneiden, 2) nur Platzierung 2 Sektionen pro Objektträger, 3) die Durchführung aller Dehydration Schritte auf Eis, 4) Zugabe von RNase Inhibitor, um den Fleck, 5) erhöht die Dehydratisierung Dauer in den letzten 100% Ethanol bis 3 Minuten. </p><p class="jove_content"> Im Hinblick auf die Erfassung, fühlen wir, dass die Kombination von CapSure HS Kappen, mit der Software auf Makro-Einstellung, sollte für optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Ein Feuchte-kontrollierten Umgebung ist entscheidend für die Erfassung von einzelnen Zellen, wie hohe Luftfeuchtigkeit drastisch reduziert Gewebe &quot;lift&quot;. Hohe Temperaturen können auch einen negativen Effekt auf die RNA-Qualität. </p><p class="jove_content"> Während der RNA-Isolierung Protokoll mit dem PicoPure Kit gibt es zwei Waschschritte. Es ist wichtig zu überprüfen, ob alle Waschpuffer vor der Übertragung auf ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Elution entfernt ist, wie jede Gegenwart des Puffers in die endgültige Probe wird in weniger Ausgangs-RNA zur Verstärkung führen. Um dies zu gewährleisten, Zentrifuge wir die letzte Waschschritt für 2,5 Minuten statt 2 Minuten, wie im Protokoll vorgesehen vorgeschlagen. </p><p class="jove_content"> Zum größten Teil wurde die lineare Verstärkung Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. Allerdings sollten zwei wichtige Punkte berücksichtigt werden, wenn dieses Protokoll verwenden: 1) versuchen, um den Verlust der RNA über mehr als die Übertragung von Proben Grenze zwischen Rohren, indem nur die 0,5 ml Röhrchen in Verbindung mit einem 0,5 ml-Block in den Thermocycler zur Verfügung gestellt und 2) bei der Übertragung der Probe auf die Reinigung Spalte für die Reinigung von cDNA, achten Sie darauf, Spin-down der Probenröhrchen nach der ersten Übertragung. Dies wird in einer zusätzlichen 1-2UL der Probe auf die Reinigung Spalte hinzuzufügen und kann daher cDNA Besserung steigt führen. </p><p class="jove_content"> Bei der Nutzung der TURBO End-Labeling Kit für Biotin-Markierung von Ihrer begrenzten aRNA Proben, empfehlen wir Ihnen das Hinzufügen eines zusätzlichen wenigen ul ist von Wasser vor dem Zentrifugationsschritt zur Erhöhung der markierten RNA aus der Säule entnommen Ertrag. Eine zusätzliche Minute Zentrifugation wird auch in dieser Hinsicht helfen, besonders wenn Sie mit dem abgebauten Gewebe, wie FFPE Gewebe arbeiten. </p><p class="jove_content"> Wir sind zuversichtlich, dass dieses Protokoll wird dem Benutzer zu ermöglichen kleinen homogenen Strukturen wie einzelne Zellpopulationen in heterogenen postmortalen Hirngewebe zu isolieren. Dies reduziert Verwässerungseffekte von umgebenden Strukturen und anderen Zelltypen in den verschiedenen Schichten innerhalb des Gehirns lokalisiert ist, was die Ergebnisse auf die spezifischen Zelltypen untersucht ausgerichtet. Da die Qualität der resultierenden RNA ist gut genug für Microarray-Studien, können wir beginnen, spezifische molekulare Signaturen von spezifischen Zellpopulationen in Krankheit betroffenen Staaten lokalisieren. </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Wir schlugen vor, die graue Substanz Reduzierung der oberen temporalen Gyrus bei Schizophrenie-Patienten gesehen zu untersuchen, durch Abfrage Genexpressionsprofile Pyramidenneuronen in Schicht III. Es ist bekannt, dass die Großhirnrinde einen außergewöhnlich heterogene Struktur aus unterschiedlichen Regionen, Schichten und Zelltypen, die jeweils durch verschiedene zelluläre und molekulare Zusammensetzung und somit differenziellen Genexpression Profile gekennzeichnet ist. Zur Umgehung der verwirrenden Wirkungen einer Gewebekultur Heterogenität, haben wir Laser-Mikrodissektion (LCM), um unsere spezifischen Zelltyp dh Pyramidenneuronen isolieren. </p><p class="jove_content"> Etwa 500 Pyramidenneuronen mit dem Histogene Färbelösung gefärbt wurden unter Verwendung des Arcturus XT LCM-System. RNA wurde dann von eingefangenen Zellen isoliert und unterzog sich zwei Runden T7-basierte lineare Verstärkung mit Arcturus / Molecular Devices Kits. Die Experion LabChip (Bio-Rad)-Gel und Elektropherogramm angegeben guter Qualität a (m) RNA, eine Abschrift Länge erstreckt Vergangenheit 600nt für Microarrays erforderlich. Die Menge der mRNA erreicht durchschnittlich 51μg, mit akzeptablen Mittelwert Probenreinheit wie von der A260/280 Ratio von 2,5 angegeben. Die Genexpression wurde profiliert mit dem Human X3P GeneChip Sondenarray von Affymetrix. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Wir beschreiben ein Verfahren mittels Laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren RNA aus einer homogenen Zellpopulation, pyramidalen Neuronen in der Schicht III des oberen temporalen Gyrus in postmortalen menschlichen Gehirnen. Wir anschließend linear verstärken (T7-based) mRNA und hybridisieren die Probe auf die Affymetrix menschlichen X3P Microarray.</p>

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Aufrufe.  McLean Hospital. Wir beschreiben ein Verfahren mittels Laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren RNA aus einer homogenen Zellpopulation, pyramidalen Neuronen in der Schicht III des oberen temporalen Gyrus in postmortalen menschlichen Gehirnen. Wir anschließend linear verstärken (T7-based) mRNA und hybridisieren die Probe auf die Affymetrix menschlichen X3P Microarray.