<p class="jove_content"> Agradecemos dispositivos moleculares tecnologias Analítica / Arcturus por sua generosa doação de reagentes utilizados para o estudo. Agradecemos também à Harvard Centro de Recursos para a prestação de tecido tecido cerebral humano postmortem <strong>Financiamento:.</strong> RO1MH76060 e P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Aqui, tentamos personalizar um protocolo para extrair populações de células homogêneas a partir de tecido cerebral post-mortem heterogêneos usando o Arcturus XT sistema e kits de extração de RNA relacionados. Conforme descrito acima, fizemos algumas modificações para os protocolos originais fornecidos pela empresa, a fim de maximizar a integridade do RNA. A captura de sucesso de uma única célula depende apenas otimizar os passos antes da captura, a fim de atingir células máxima com RNA bom. Essas etapas incluem os vários parâmetros associados com tecido de corte e coloração. Em suma, no que diz respeito à preparação de tecidos que incluem: 1) diminuição do gradiente de temperatura ao fazer cortes, 2) apenas colocando dois pontos por slide, 3) realizar todas as etapas de desidratação no gelo, 4) a adição de inibidor de RNase para a mancha, 5) o aumento a duração de desidratação de etanol no final de 100% a 3 minutos. </p><p class="jove_content"> Com relação à captura, nós sentimos que a combinação de CapSure HS caps, com o software de configuração Macro, deve assegurar os melhores resultados. Um ambiente com controle de umidade é fundamental para capturar células individuais, como alta umidade reduz drasticamente &quot;levantar&quot; o tecido. As altas temperaturas também pode ter um efeito negativo na qualidade do RNA. </p><p class="jove_content"> Durante o protocolo de isolamento de RNA com o kit PicoPure, há duas etapas de lavagem. É importante verificar que todos tampão de lavagem é removido antes de transferir para outro tubo de microcentrífuga para a eluição RNA, como qualquer presença do tampão na sua amostra final vai resultar em menos RNA de partida para a amplificação. Para garantir isso, centrifugar a etapa de lavagem final para 2,5 minutos em vez de dois minutos, conforme sugerido no protocolo fornecido. </p><p class="jove_content"> Para a maior parte, o protocolo de amplificação linear foi de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, dois pontos cruciais devem ser tidos em conta quando se utiliza este protocolo: 1) tentar limitar a perda de RNA via transferência de excesso de amostras entre os tubos, usando apenas os tubos de 0,5 ml fornecida em conjunto com um bloco de 0,5 ml no termociclador e 2) ao transferir a amostra para a coluna de purificação para a purificação do cDNA, certifique-se de girar os tubos de amostra após a primeira transferência. Isso resultará em um adicional de 1-2ul de exemplo para adicionar à coluna de purificação e, portanto, pode aumentar a recuperação de cDNA. </p><p class="jove_content"> Ao fazer uso do kit final rotulagem TURBO para biotina rotulagem de suas amostras ARNA limitada, sugerimos acrescentar um extra alguns mL de água antes da etapa de centrifugação, para aumentar o rendimento de RNA marcado extraído da coluna. Um minuto extra de centrifugação também vai ajudar nesse sentido, especialmente se você estiver trabalhando com tecido degradadas, como o tecido FFPE. </p><p class="jove_content"> Estamos confiantes que este protocolo vai permitir que o usuário isolar pequenas estruturas homogêneas, como populações de células individuais, dentro do tecido heterogêneo pós-morte cerebral. Isto reduz os efeitos de diluição das estruturas vizinhas e outros tipos de células localizadas nas várias camadas dentro do cérebro, levando a resultados orientados para os tipos de células específicas sob investigação. Como a qualidade do RNA resultante é bom o suficiente para estudos de microarray, podemos começar a identificar assinaturas moleculares específicas de populações de células específicas afetadas na doença de estados. </p>

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Propusemos a investigar a redução da substância cinzenta no giro temporal superior visto em pacientes com esquizofrenia, interrogando perfis de expressão gênica de neurônios piramidais da camada III. É sabido que o córtex cerebral é uma estrutura extremamente heterogênea compreendendo diversas regiões, camadas e tipos de células, cada qual é caracterizado por composições distintas celular e molecular e perfis de expressão, portanto, diferencial de genes. Para contornar os efeitos de confusão de heterogeneidade de tecidos, foi utilizado laser de captura de microdissecção (LCM), a fim de isolar os nossos neurônios específicos de células do tipo ie piramidal. </p><p class="jove_content"> Cerca de 500 neurônios piramidais corados com a solução de coloração Histogene foram capturados usando o Arcturus XT sistema LCM. RNA foi então isolado a partir de células capturado e passou por duas rodadas de T7 baseado em amplificação linear usando Arcturus / kits Molecular Devices. O LabChip Experion (Bio-Rad) e gel electrofograma indicados de boa qualidade uma RNA (m), com um comprimento estendendo transcrição 600nt passado necessários para microarrays. A quantidade de mRNA obtido média de 51μg, com a pureza da amostra aceitável dizer como indicado pela relação A260/280, de 2,5. Expressão gênica foi retratado usando o Human X3P série sonda GeneChip da Affymetrix. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.</p>

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K visualizações.  McLean Hospital. Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.