<p class="jove_content"> Nous remercions Molecular Devices technologies analytiques / Arcturus pour leur généreux don de réactifs utilisés pour l&#39;étude. Nous remercions également le Centre de Harvard ressources pour fournir des tissus post-mortem du tissu cérébral humain <strong>Financement:.</strong> RO1MH76060 et P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> La production de cette vidéo article a été parrainé par Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Ici, nous essayons de personnaliser un protocole pour extraire les populations de cellules homogènes à partir de tissus post-mortem du cerveau hétérogènes utilisant le système d&#39;Arcturus XT et des kits d&#39;extraction d&#39;ARN liées. Comme indiqué plus haut, nous avons apporté quelques modifications aux protocoles originaux fournis par l&#39;entreprise, afin de maximiser l&#39;intégrité ARN. La capture réussie de cellules individuelles dépend uniquement de l&#39;optimisation des étapes avant la capture afin d&#39;atteindre les cellules au maximum avec de l&#39;ARN bon. Ces étapes comprennent les différents paramètres associés à des tissus de sectionnement et coloration. En bref, en ce qui concerne la préparation des tissus, notamment: 1) réduire le gradient de température lors de sectionnement, 2) que de placer deux sections par diapositive, 3) exécuter toutes les étapes de la déshydratation sur la glace, 4) en ajoutant l&#39;inhibiteur de RNase à la tache, 5) l&#39;augmentation la durée de déshydratation dans la finale d&#39;éthanol à 100% à 3 minutes. </p><p class="jove_content"> En ce qui concerne la capture, nous pensons que la combinaison de CapSure HS casquettes, avec le logiciel sur le réglage macro, devrait garantir des résultats optimaux. Un environnement à humidité contrôlée est critique pour la capture des cellules individuelles, que l&#39;humidité élevée réduit considérablement les tissus &quot;ascenseur&quot;. Des températures élevées peuvent aussi avoir un effet négatif sur la qualité de l&#39;ARN. </p><p class="jove_content"> Pendant le protocole d&#39;isolement d&#39;ARN avec le kit PicoPure, il ya deux étapes de lavage. Il est important de vérifier que tous les tampons de lavage est retirée avant le transfert à un autre tube à centrifuger pour l&#39;élution d&#39;ARN, comme toute présence de la mémoire tampon dans votre échantillon final se traduira par moins d&#39;ARN de départ pour l&#39;amplification. Pour ce faire, nous avons l&#39;étape de centrifugation lavage final pendant 2,5 minutes au lieu de 2 minutes comme le suggère le protocole fourni. </p><p class="jove_content"> Pour la plupart, le protocole d&#39;amplification linéaire a été conformément aux instructions du fabricant. Toutefois, deux points cruciaux doivent être pris en compte lors de l&#39;utilisation de ce protocole: 1) essayer de limiter la perte de l&#39;ARN par l&#39;intermédiaire de transférer l&#39;excès d&#39;échantillons entre les tubes, en utilisant uniquement des tubes 0.5ml fournis en conjonction avec un bloc de 0,5 ml dans le thermocycleur et 2) lors du transfert de l&#39;échantillon à la colonne de purification pour la purification de l&#39;ADNc, n&#39;oubliez pas de spin-down des tubes d&#39;échantillon après le premier transfert. Cela se traduira par un supplément de 1-2UL de l&#39;échantillon à ajouter à la colonne de purification et ne peut donc augmenter la récupération d&#39;ADNc. </p><p class="jove_content"> Lors de l&#39;utilisation du TURBO fin kit de marquage pour la biotine-étiquetage de vos échantillons ARNa limité, nous vous suggérons d&#39;ajouter un supplément de quelques ul d&#39;eau avant l&#39;étape de centrifugation, d&#39;augmenter le rendement de l&#39;ARN étiquetés extraite de la colonne. Une minute supplémentaire de centrifugation seront également utiles à cet égard, surtout si vous travaillez avec des tissus dégradés, tels que les tissus FFPE. </p><p class="jove_content"> Nous sommes convaincus que ce protocole permettra à l&#39;utilisateur d&#39;isoler de petites structures homogènes, comme les populations seule cellule, au sein de tissus post-mortem du cerveau hétérogène. Cela réduit les effets de dilution des structures environnantes et d&#39;autres types de cellules situées dans les différentes couches dans le cerveau, conduisant à des résultats ciblés vers les types de cellules spécifiques de l&#39;enquête. Comme la qualité de l&#39;ARN résultant est assez bon pour les études de puces à ADN, nous pouvons commencer à identifier des signatures moléculaires spécifiques des populations de cellules spécifiques affectés dans les états pathologiques. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Nous avons proposé d&#39;étudier la réduction de matière grise dans le gyrus temporal supérieur chez les patients schizophrènes, en interrogeant les profils d&#39;expression génique des neurones pyramidaux dans la couche III. Il est bien connu que le cortex cérébral est une structure extrêmement hétérogène comprenant diverses régions, des couches et des types de cellules, dont chacune est caractérisée par des compositions distinctes cellulaire et moléculaire et donc différentielle des profils d&#39;expression génique. Afin de contourner les effets confondants de l&#39;hétérogénéité des tissus, nous avons utilisé la capture microdissection laser (LCM) afin d&#39;isoler notre spécifiques de type cellulaire des neurones pyramidaux savoir. </p><p class="jove_content"> Environ 500 neurones pyramidaux colorés avec la solution de coloration ont été capturés à l&#39;aide Histogene l&#39;Arcturus LCM XT système. L&#39;ARN a ensuite été isolé à partir des cellules capturées et subi deux séries de T7 à base d&#39;amplification linéaire à l&#39;aide d&#39;Arcturus / Molecular Devices trousses. Le LabChip Experion (Bio-Rad) de gel et de bonne qualité électrophérogramme indique un ARN (m), avec une longueur de transcription étendre 600nt dernières requis pour biopuces. La quantité d&#39;ARNm obtenu en moyenne 51μg, avec la pureté des échantillons acceptables dire, comme indiqué par le ratio A260/280, de 2,5. L&#39;expression des gènes a été profilé à l&#39;aide du tableau de l&#39;homme X3P sonde GeneChip d&#39;Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Nous décrivons un processus utilisant le laser capture microdissection d&#39;isoler et d&#39;extraire l&#39;ARN à partir d&#39;une population cellulaire homogène, les neurones pyramidaux, dans la couche III du gyrus temporal supérieur dans les cerveaux post-mortem humain. Nous avons ensuite linéairement amplifier (T7-based) ARNm, et s&#39;hybrident l&#39;échantillon à la puce Affymetrix humaines X3P.</p>

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K vues.  McLean Hospital. Nous décrivons un processus utilisant le laser capture microdissection d'isoler et d'extraire l'ARN à partir d'une population cellulaire homogène, les neurones pyramidaux, dans la couche III du gyrus temporal supérieur dans les cerveaux post-mortem humain. Nous avons ensuite linéairement amplifier (T7-based) ARNm, et s'hybrident l'échantillon à la puce Affymetrix humaines X3P.