המחברים מבקשים להודות E. דה לה רוזה ו-AI Valenciano לעזרה ראשונית עם הקמתה של התרבויות organotypic ו ע ו U. לאוב Gerster לקבלת סיוע טכני.

כל הציוד ריאגנטים צריך להיות סטרילי לרכוש או צריך להיות חום או קיטור מעוקר או מעוקר עם ETOH 70%. המדינה המחברים כי ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הקהילות האירופיות Council Directive (86/609/EEC), בעקבות הנחיות של NIH לגבי טיפול השימוש בבעלי חיים הפרוצדורות והתקנות שנקבעו על ידי בעלי חיים המוסדי טיפול השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת דואיסבורג-אסן (גרמניה). חלק 1: Enucleation העיניים Murine של שלבי התפתחות שונים Enucleation העיניים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזדווגויות זמן בהריון הן להגדיר את הבוקר של היום שבו תקע הנרתיק מזוהה ההזדווגות הנקבות מיועדת 0 יום ההריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקבה בהריון היא הקריבה על ידי נקע בצוואר הרחם, כאשר התפתחות העוברים הגיע השלב הרצוי (כאן: יום עובריים (E) 15) קבוע על שעווה לוח 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופן הבטן היא טבולה ETOH 70%, לחתוך לאורך קו האמצע לבין דשי העור קבועים רוחבית של 6 פינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uterusses יוסרו מן הבטן, מנותקת והועברו מבחנה עם PBS קר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מופרדים, הועבר צלחת פטרי קיר הרחם והקרומים עובריים יוסרו בקפידה על ידי שימוש במלקחיים 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים נהרגים על ידי עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיניים הן enucleated להיות בשימוש, מלקחיים בסדר מעוקל, &quot;פילינג&quot; העיניים של ארובת העין. </li></ol> Enucleation העיניים הלידה למבוגרים <ol start="1" type="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורים צעירים נהרגים על ידי, עריפת ראש גורים גדולים ומבוגרים על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד שלב הלידה p15, נקודת הזמן שבו עכברים לפקוח את עיניהם, חרכים לעיניים יש להיפתח באופן מכני על ידי שימוש במלקחיים והורחב על ידי שני חתכים רוחביים של העפעפיים העין במספריים האביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיניים הן enucleated על ידי עזרה של מלקחיים מעוקל, הפעלת לחץ על מסלול. </li></ol> הערה: בכל יום לאחר הלידה 2, עצמות מסלולית עדיין סחוסי, חשוב לא להפעיל לחץ רב מדי בעת שניסה להסיר את העיניים. לעומת זאת, בעכברים בוגרים, העצמות הן מסלולית המשרד. לפיכך, על מנת enucleate בעיני זה מספיק כדי להפעיל לחץ על מסלול ללא הגדלת חרכים לעיניים מראש. חלק 2: Dissection של הרשתית Murine עובריים, לאחר הלידה למבוגרים Dissection של הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיניים ממוקמות בתוך צלחת פטרי קטנה עם סטרילי PBS ואת שכבות העין מסביב מוסרים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את שכבות העין החיצונית, בשלבי הלידה ועיניים המבוגר עצב הראייה צריכה להיות מנותקת על ידי עזרה של מספריים באביב או לבטל צבט ידי מלקחיים כמו לסגור את הבסיס האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את העין, כך הצד האחורי עם חור שבו עצב הראייה התגוררו במקור הוא פונה אליך. הזן את החלל subretinal בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט בקצות שני מלקחיים יפה מאוד מהאתר שבו עצב הראייה חדרה שכבות העין. הערה: בדרך כלל, אפיתל הפיגמנט ניתן לזהות בקלות לפי צבעו הכהה. בכמה זני עכבר מוטנטי - בעיקר אצל בעלי חיים לבקנים - זו שכבת פיגמנט עשויים עם זאת, לא להיות בצבע ולכן לא ניתן לזהות בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אפיתל הפיגמנט עם קרום דמית העין sclera מצורף בקפידה על ידי קריעה צד עם מלקחיים שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף את השכבות עד לרמה של הקרנית, ולאחר מכן להפוך את הכוס עין לצד העדשה להסיר את הקרנית יחד עם פיגמנט האפיתל, קרום דמית העין והלחמית, בעוד מחזיק את כוס הרשתית הנותרים על ידי מלקחיים אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז זגוגי יחד עם עדשה קטנה תוך קריעת עם מלקחיים, לשמור על wholemount הרשתית במקום עם מלקחיים השני. הערה: כאשר מנתחים את העיניים עובריים, הקפד להסיר לחלוטין את משולש, דמוי אוהל מתחת מקלעת נימי הגוף הזגוגי יחד עם הזגוגית. בעיני המבוגרים, הזגוגית צריך להיות תפס בצדדים טיפול יש לקחת לא הזגוגית לחדור בקצות מלקחיים כמו התוכן שלה הוא צמיג ומקלות על מלקחיים, פוגע הסרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך תרבות wholemount organotypic כוסות הרשתית נאספים צלחת 96-היטב המכיל 200 בינוני μl שונה Dulbecco של הנשר (ראה להלן). </li></ol> הערה: בין דיסקציה של הרשתית בודדים, להשאיר את צלחת 96-גם אוסף המכיל את המדיום תרבות בחממה כמו ה-pH של המדיום תרבות מופעלת על ידי ה-CO 2 באמצעות מערכת קרבונט. חלק 3: Murine wholemount רשתית organotypicתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל ידי בינוני תרבות שונה שקלול 7.8g Dulbecco של הנשר / תערובת מזין F-12 HAM (DMEM) ו 0.6g NAHCO 3 והמסה הן מים MiIliQ. התאם את ה-pH על 7.15. הוסף 50 מ&quot;ג apo-transferin, 50μl putrescin (מניות: 60mg/ml), נתרן סלניום 50μl (מניות: 52μg/ml), פרוגסטרון (מניות: 60μg/ml), ו - 2.5 מ&quot;ל gentamicine (200 מ&quot;מ) מתחת למכסה המנוע. לערבב ולסנן דרך פילטר בראש הבקבוק. מיד לפני השימוש להוסיף גלוטמין 10μl (200 מ&quot;מ) לכל מדיום תרבות מ&quot;ל. הערה: בינוני בסרום ו אינסולין ללא יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות המשמשים בניסויים אינדוקציה אפופטוזיס כמו אינסולין לא מנטרל את ההשפעות. אם הדגירה של wholemounts יותר מ 24 שעות הוא הרצוי ומוות שיעורי התא לא תוערך, סרום אינסולין (למשל העובר עגל בסרום; FCS) או תוספי יש להוסיף כדי לשפר את שיעורי ההישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את התרבות, wholemounts הרשתית הם מראש מודגרות במשך 15 דקות ב 37 מעלות עם 200 μl חם, pH מאוזן DMEM המכיל hyaluronidase 0.5mg/ml מראש לעכל את hyaluronidase המכיל קרום הגבלת הפנימיים והחיצוניים של גליה ller M תאים, חדירה של חומרים להקל להחיל exogenously. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתיות מועברים צלחת 24 גם עם hyaluronidase כמו מעטים ככל האפשר ותרבותיים כמו wholemounts organotypic ב 2ml הגדרה כימית מדיום שונה נשר של Dulbecco. הערה: העברת הרשתית, השתמש פיפטה 1ml וחתך את קצה פיפטה כמה מילימטרים כדי להרחיב את הפתח. עבור העיניים עובריים, טיפ 200 פיפטה μl מספיק. קצוות חיתוך צריך להיות והחלקתי על ידי החדרת מתפתל של קצה פיפטה השני. במשך 24-48 שעות לטווח קצר תרבויות, כל השלבים יכול להתבצע על הספסל, אבל אם זיהום של תרבויות מתברר שיש בעיה, צריך לעבוד מתחת למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות נשמרות במשך 24-48 שעות ב 37 ° C באווירה 5% CO 2 ו למשל נתון טיפול תרופתי עם גורמים רקומביננטי. </li></ol> חלק 4: דיסוציאציה של wholemounts רשתית תרבותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן תרבות הרצוי, הרשתית נאספים צינורות 2ml Eppendorf עם תחתית עגולה המכילה 850 μl PBS ו 50 μl שור בסרום albumine (BSA, 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינורות Eppendorf עם הרשתיות לגוש חימום, התחממו על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl collagenase (200 U / ml) ו - 25 hyaluronidase μl (20mg/ml) על צינור אחד Eppendorf ולהתחיל dissociating לתוך הרשתית ההשעיה תא בודד על ידי 3 עובר siliconized פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl טריפסין (1mg/ml), להמתין 3-5 דקות, ואז לאט לאט פיפטה 3-5 פעמים למעלה ולמטה עם siliconized פיפטה פסטר כדי לנתק את הרקמה באופן מכני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl DNase אני (5mg/ml), שוב להמתין 3-5 דקות, ואז לאט לאט פיפטה 3-5 פעמים למעלה ולמטה עם siliconized פיפטה פסטר. הערה: זמן הדגירה של דיסוציאציה האנזימטית משתנה תלוי בגודל של העיניים ואת השלב ההתפתחותי, בהתאמה. בדוק את שלב עיכול אנזימטי של הרקמה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההשעיה התא אינו הומוגני עד עכשיו אבל עדיין מכיל תא מרכזי אגרגטים, להוסיף טריפסין נוספים μl 10 ו 10 μl DNase I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההשעיה התא הוא הומוגני, עיכול של רקמת הוא נעצר על ידי תוספת של 10 μl EDTA (0.5 מ &#39;), צינורות Eppendorf יוסרו מן התנור ואת השעיות תא קבועים עבור 1h על ידי תוספת של paraformaldehyde 1ml טריים, קרח קר 8% (PFA) בטמפרטורת החדר על סיבוב שייקר. </li></ol> חלק 5: כביסה של המתלים התא ניתק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים התא centrifuged 5 דקות ב 4 ° C ו ב RCF 0.2 בצנטריפוגה קירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant הוא מושלך לבין גלולה מחדש תלויה 1ml PBS המכיל 3mg/ml BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שחזר הפעולות כביסה פעמיים, גלולה הוא סוף סוף מחדש תלויה 500 μl PBS המכיל 3mg/ml BSA, EDTA 5mm ו אזיד הנתרן 0.1%. </li></ol> הערה: תוספת של חומצה נתרן לאפשר אחסון של השעיה התא במשך כמה ימים בבית 4 ° C. עם זאת, אם מכתים immunocytochemical יעברו, לא מוסיפים חומצה נתרן למאגר resuspension, כמו זו גורמת לאובדן איכות מכתים. חלק 6: Cytospin של המתלים התא אפופטוזיס כמותי וניתוח התפשטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית חלבית סוף מיקרוסקופ, מסנן cytospin עם אחד או שניים חורים משפך cytospin מוכנסים לתוך סרטון שקופיות cytospin. קליפ השקופית סגור מיקומו הרוטור cytospin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה התא ניתק הוא הומוגני ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. הערה: בהתאם לשלב ההתפתחותי של הרשתית, על השעיית התא מההליך דיסוציאציה ייתכן שתצטרךלהיות מדולל עם PBS לקבל מספר מנייה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (100 μl) השעיה של התא מוחל משפך cytospin. הערה: כאשר pipetting ההשעיה התא המשפך, קצה פיפטה צריך להגיע את כל הדרך למטה אל החלק התחתון של המשפך. חשוב לא לדחוף דרך נקודת הלחץ השני של פיפטה כמו זה יוצר בועות אוויר, אשר יוצגו במקום התא לאחר cytospin וצידניות ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה התא הוא הבחין בשקופית בסל&quot;ד 700 דקות 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקביעת ההשפעה של גורמים להחיל exogenously על רמות אפופטוזיס בתאי ניתן מוכתם 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), רכוב עם פלורסנט בינוני גובר. שינויים אפופטוזיס בתא ניתן לקבוע על ידי ספירת לפחות 1000 תאים (הכוללת לפחות 10 גרעינים pycnotic) במקומות תא cytospin ושיעור מוות של תאים מחושבים כאחוז של תאים הכולל סעיפים 3,4. הערה: לחלופין, הפצת גרעין אפופטוטיים ניתן להעריך flatmounts 3 או cryostat sections4 של wholemounts רשתית תרבותי על ידי תיוג TdT בתיווך ניק סוף dUTP (TUNEL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של התפשטות תאים, BrdU (5 מיקרומטר) ניתן להוסיף 6 שעות לפני תום התרבות ושילוב BrdU דמיינו cytospins homogenates של התא על ידי מכתים immunocytochemical באמצעות נוגדן אנטי BrdU (למשל התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק, איווה, ארה&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשפעה של הטיפול על סוגי תאים שונים ברשתית ניתן דמיינו ב cytospins על ידי נוגדנים ספציפיים כמו Brn3a נוירון (תא סמן גנגליון) או opsin (photoreceptor סמן) ו counterstaining עם DAPI. </li></ol> חלק 7: תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> איור 1: שלבים בהכנת Murine wholemounts רשתית organotypic ראש של עכבר עם שתי העיניים. B עין Murine עם הצד העדשה למעלה, כל השכבות עדיין במקום. C עין Murine מהישבן עם עצב הראייה עדיין מחוברת. העין D Murine עם בלובן העין ו פיגמנט האפיתל שהוסרה חלקית. E הרשתית Murine עם אפיתל, הקרנית והלחמית פיגמנט להסיר לחלוטין, אבל העדשה זגוגי עדיין במקום. F Murine כוס wholemount הרשתית עם העדשה זגוגי הוסרו. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="איור 2" /> איור 2: ניתוח של תרבויות organotypic wholemount הרשתית על ידי cytospin וחתכים לניתוח של אפופטוזיס, cytospins של המתלים התא ניתק מוכתמות DAPI גרעינים pycnotic ניתן להבחין על ידי פיצול גרעיני או עיבוי הכרומטין (ראשי חץ ב). לחלופין, קטעים wholemount (לסה&quot;נ; יום הרשתית Murine לאחר הלידה (P) 2) או flatmount הרשתית (F) יכולה להיות נתונה assay TUNEL ו counterstained עם DAPI (E). ההשפעה של הטיפול על סוגי תאים שונים ברשתית ניתן דמיינו ב cytospins על ידי נוגדנים ספציפיים כמו נוירון לתא הגנגליון סמן Brn3a (החצים B) GCL, תא שכבת הגנגליון;. INL, פרוספקטיבי שכבת הגרעין הפנימית. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

היתרון של 2-5 תרבויות Murine רשתית organotypic wholemount על ​​דיסוציאציה, monolayer, retinospheroid או מחדש מצטברים תרבויות spheroid 3D 1 טמון בשימור אינטראקציות קשרים עצביים, מחקה את המצב vivo. לשם השוואה דיווחים 2 לשעבר, במאמר וידאו שלנו מספק הדגמה מפורטת של מוזרויות ב enucleation...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

כריתה ממוקדת של גנים ואנליזה של מודלים של בעלי חיים היא האסטרטגיה הקלאסית עבור להרשם ספציפיים פונקציה גן הרשתית. עם זאת, מהונדס, הרשתית ספציפי או מותנה עכבר מודלים בנוקאאוט לעתים קרובות להציג הקטלניות מוקדם או סובלים ממומים קשים, מניעת ניתוח מעבר בשלבים עובריים או לאחר לידה מוקדמת. תרבית תאים ראשונית מהווה חלופה כדי לחקור את ההשפעות של גורמים exogenously רקומביננטי מיושם, overexpression של גנים או siRNA בתיווך מציאה גן בסביבה מבוקרת. תרבית תאים ניתק יש את היתרון כי אותות אנדוגני להגיע לתאי היעד מופחתים, ובכך להקל על זיהוי תופעות מופעלות exogenously לאחר מניפולציה תרופתי. עם זאת, חשוב תאים תאים אינטראקציות נהרסים בתחילה על ידי עיכול אנזימטי או ניתוק מכני, גם אם מחדש מצטברים תרבויות retinospheroid 1 משמשים. לעומת זאת, organotypic תרבויות wholemount רשתית לספק מערכת קרוב פיזיולוגיים במצב vivo עם אינטראקציות קשרים עצביים 2-5 נשמר עדיין. במאמר זה אנו מספקים וידאו צעד אחר צעד הפגנה של הממסד (1) in vivo של דמוי organotypic תרבויות wholemount ברשתית כולל מוזרויות דיסקציה של העיניים Murine עובריים, לאחר הלידה למבוגרים ו (2) הליך התנתקות cytospin לניתוח של נוירונים אפופטוזיס ובחלוקה של תאים ברשתית ב wholemounts organotypic, למשל אחרי התרבות בנוכחות exogenously גורמים רקומביננטי מיושם.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture at JoVE.com

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות את<em&gt; In vivo</em&gt; המצב להקל באופן משמעותי את הנגישות של הרשתית Murine עבור מניפולציות ניסיוני תוך עקיפת והחסרונות של קלאסית במודלים של בעלי חיים Murine.

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K Views.  University of Duisburg-Essen. מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות את In vivo המצב להקל באופן משמעותי את הנגישות של הרשתית Murine עבור מניפולציות ניסיוני תוך עקיפת והחסרונות של קלאסית במודלים של בעלי חי...

Video: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...