著者は、技術支援のための器官培養およびU. LaubとU.ゲルスターの設立と初期支援のためにE.デラロサとAI Valencianoに感謝します。

すべての機器および試薬は、滅菌購入する必要がありますまたは熱または蒸気滅菌または70％エタノールで滅菌する必要があります。 動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学（ドイツ）での委員会（IACUC）を使用してください。 パート1：異なる発達段階のマウスの目の核出術胚の眼の摘出<ol><li>時間妊娠交配が設定され、膣栓が女性の交配で検出される日の朝は、妊娠0日を指定されます。 </li><li>とワックス基板6上に固定されて：胚の開発が必要な段階（日胚（E）15ここでの）に達したときに妊娠した女性は、頸椎脱臼により屠殺された。 </li><li>腹壁を正中線に沿って切断し、皮膚フラップはピン6で横方向に固定され、70％エタノールで湿らされています。 </li><li> uterussesは切り離さと冷PBS 6のビーカーに移し、腹部から削除されます。 </li><li>胚を分離し、ペトリ皿と子宮の壁に転送し、胚の膜を鉗子6の使用で慎重に除去されています。 </li><li>胚は、斬首によって殺される。 </li><li>眼は眼窩から目を&quot;剥離&quot;、罰金、湾曲鉗子の使用となる摘出されています。 </li></ol>出生後と大人の目の摘出<ol start="1" type="1"><li>若い仔は、頚椎脱臼により斬首、古い子犬や大人に殺されている。 </li><li>最大出生後の段階P15に、マウスは、彼らの目を開く時のポイント、目のスリットは、機械的に鉗子を使用して開かれ、春のはさみとまぶたの二つ横カットを拡大する必要があります。 </li><li>目が軌道に圧力をかけて、湾曲鉗子の助けによって摘出されています。 </li></ol>注：、軌道の骨はまだ軟骨な生後2日目の時点で、それは目を削除しようとしたときに過剰な圧力を適用しないことが重要である。 これとは対照的に、成体マウスでは、軌道骨は会社です。このように、目を摘出するためには、事前に目のスリットを大きくすることなく軌道への圧力を適用するのに十分です。 パート2：胚、生後および成体マウスの網膜の解剖網膜の解剖<ol><li>目は、滅菌PBSと周囲の目の層を持つ小型のペトリ皿に置かれている解剖顕微鏡下で除去されています。 </li><li>外側の目のレイヤーを削除するには、出生後の段階と大人の目には視神経はできるだけ基礎の近くに鉗子で春のハサミやピンチオフの助けによって切断する必要があります。 </li><li>視神経が最初に格納されていた穴の裏面が手前になるように、目を回す。視神経が目の層を貫通サイトから2つの非常に微細な鉗子の先端と網膜と色素上皮の間に網膜下腔を入力してください。 注：通常、色素上皮が容易にその暗い色によって識別することができます。一部のマウス変異株では - 特にアルビノの動物で - この色素層はしかし、着色ができない場合がありますので、容易に検出することがあります。 </li><li>慎重に、両方の鉗子でいずれかの側に切断すると、添付脈絡膜と強膜と色素上皮を削除します。 </li><li>他の鉗子で、残りの網膜のカップを保持しながら、アップ角膜のレベルまでの層を剥がし、その後、レンズ側にアイカップをオンにし、色素上皮、脈絡膜と強膜と一緒に角膜を削除します。 </li><li>小さなレンズと一緒に硝子体をつかみ、ピンセットで涙ながら、第二鉗子と場所で網膜wholemountを保つ。 注：胚の目を解剖すると、完全に硝子体と一緒に硝子体の下三角、テントのような毛細血管叢を除去することを確認してください。 大人の目では、硝子体は、側面で把握する必要があるとケアは、その内容がその削除を妨げ、鉗子の粘性とムチそのまま鉗子の先端ではなくピアス硝子体に取られる必要があります。 </li><li>器官wholemount文化のために網膜のカップは、200μlのダルベッコ改変イーグル培地（下記参照）を含む96ウェルプレートに収集されます。 </li></ol>注：個々の網膜の解剖の間に、培地のpHは炭酸系を介してCO 2によってトリガされるようにインキュベーター中の培地を含む96ウェルコレクションプレートを維持する。 パート3：マウス器官網膜wholemount文化<ol><li>重み7.8グラムダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F - 12 HAM（DMEM）と0.6グラムのNaHCO 3とMiIliQ水の両方を溶解して500mlの文化を準備します。 7.15にpHを調整する。ボンネットの下、および2.5ミリリットルgentamicine（200 mM）を、50μlの亜セレン酸ナトリウム（株式：：52μg/ml）、プロゲステロン（60μg/ml株式）：50mgのアポtransferin、50μlのputrescin（60mg/mlストック）を追加します。ボトルトップフィルタを介して混在させるとフィルタ。使い方は、ml培養液あたり10μlをグルタミン（200mMの）を追加する直前。 注：インスリンが効果を打ち消すので、これ血清およびインスリンを含まない培地は2週間までに4℃で保存し、アポトーシス誘導の実験に使用することができます。 24時間よりも長いためwholemountsのインキュベーションが望まれると細胞死の率が評価されない場合、血清インスリン（例えばウシ胎児血清、FCS）やサプリメントは、生存率を改善するために追加する必要があります。 </li><li>文化を開始する前に、網膜wholemountsは37℃で15分間プレインキュベートされている-10 M llerのグリア細胞の内側と外側の境界膜を含むヒアルロニダーゼを事前に消化するために0.5mg/mlヒアルロニダーゼを含む200μlの暖かい、pHのバランスDMEMとCセル、外生的に適用される物質の促進浸透。 </li><li>網膜は、2ミリリットル化学的に定義されたダルベッコ改変イーグル培地中の可能性や器官wholemountsとして培養と同様にいくつかのヒアルロニダーゼで24穴プレートに転送されます。 注：網膜を転送するには、1ミリリットルピペットを使用し、開口部を広げるためにピペットの先端を数ミリを切る。胚の眼の場合は、200μlのピペットチップで十分です。刃第二ピペットチップの挿入やねじれによって平滑化されるべきである。 24〜48時間の短期培養のため、すべての手順がベンチで行うことができますが、文化の汚染が問題であることが判明した場合、一つはフードの下で動作するはずです。 </li><li> 37 5％CO 2雰囲気における° Cで48時間、組換えの要因と薬理学的処理を施して例えば-の文化は24のために維持されます。 </li></ol>第4部：培養網膜wholemountsの解離<ol><li>希望の培養時間の後、網膜を850μlのPBSと50μlのウシ血清アルブミン（、30 mg / mlのBSA）を含む丸底で2ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに回収されています。 </li><li> 37℃まで加熱加熱ブロック、℃に網膜をエッペンドルフチュー​​ブをセット</li><li>各エッペンドルフチュー​​ブに25μlのコラゲナーゼ（200 U / ml）および25μlのヒアルロニダーゼ（20mg/ml）を追加し、シリコナイズパスツールピペットを介して3つのパスで単一の細胞懸濁液中に網膜を解離開始。 </li><li> 10μlのトリプシン（1mg/ml）を追加し、3〜5分間待ってから、徐々に機械的に組織を解離するためにシリコン処理パスツールピペットで上下に3-5回ピペッティング。 </li><li> 10μlのDNase Iを（5mg/ml）を追加し、もう一度ゆっくりシリコナイズパスツールピペットで上下に3-5回ピペッティング、3〜5分間待ちます。 注：酵素的解離のためのインキュベーション時間は様々で、それぞれ、目の大きさや発達段階に依存します。優しく上下にピペッティングして組織の酵素消化の段階を確認してください。 </li><li>細胞懸濁液は今では均質ではないが、依然として大​​きな細胞凝集体が含まれている場合は、追加の10μlのトリプシンおよび10μlのDNase Iを加える</li><li>細胞懸濁液が均質である場合、組織の消化が10μlのEDTA（0.5 M）の添加により停止されている、エッペンドルフチュー​​ブをヒーターから削除され、細胞懸濁液1ミリリットル新鮮な、氷冷8％パラホルムアルデヒドを添加することによって1時間は固定されている（PFA）回転シェーカー上で室温で。 </li></ol>パート5：解離細胞懸濁液の洗浄<ol><li>細胞懸濁液は、° Cと0.2 rcfで冷却遠心機で4℃で5分間遠心分離されています。 </li><li>上清を捨て、ペレットを1ミリ​​リットルを含むPBS 3mg/ml BSAに再懸濁されている。 </li><li>回これらの洗浄工程を繰り返した後、ペレットを最終的に3mg/ml BSA、5mMのEDTAおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む500μlのPBSに再懸濁されている。 </li></ol>注：ナトリウムの酸の添加は、4で数日間℃で細胞懸濁液の貯蔵を可能にするしかし、免疫細胞化学的染色が続く場合、染色質の損失でこの結果として、再懸濁バッファーにナトリウムの酸を追加しないでください。 パート6：定量的なアポトーシスと増殖の解析のための細胞懸濁液のサイトスピン<ol><li> 1つまたは2つの穴とサイトスピン漏斗付きつや消しエンドの顕微鏡スライド、サイトスピンフィルタがサイトスピンスライドクリップに挿入されます。スライドクリップが閉じられ、サイトスピンのローターに配置される。 </li><li>解離細胞懸濁液を穏やかにピペッティングでホモジナイズする。 注：網膜の発達段階に応じて、解離の手順から細胞懸濁液が必要になる場合があります細胞の可算数を取得するためにPBSで希釈する。 </li><li>細胞懸濁液のアリコート（100μl）をサイトスピン漏斗に適用されます。 注：漏斗に細胞懸濁液をピペッティングする際、ピペットの先端は漏斗の底にすべての方法を下に到達する必要があります。これはサイトスピンした後、セルスポットに見えるように空気の泡を、作成し、細胞数を妨げるようピペットの第2の圧力ポイントを介してプッシュすることが重要です。 </li><li>細胞懸濁液は、7分間、700 rpmでスライド上にスポットされています。 </li><li>蛍光マウンティング培地でマウントされて、、アポトーシスレベルの外因的に適用される要因の効果の判定のために細胞を4&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニル（2μg/mlDAPI）で染色することができます。細胞のアポトーシスの変化は、サイトスピン細胞のスポットで、少なくとも1000個の細胞を（少なくとも10 pycnotic核を含む）カウントし、細胞の死亡率は全細胞の割合として計算される3,4を数えることによって決定することができます。 注 ：別の方法として、アポトーシス核の分布はTDT -媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）により培養網膜wholemountsのflatmounts 3またはクライオスタットsections4で評価することができます。 </li><li>文化とBrdUの取り込みの終了は、抗BrdU抗体（例えば、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ州、米国）を用いて免疫組織化学的染色により、細胞ホモジネートのcytospinsで視覚化する前に細胞増殖の検出のために、BrdUは（5μM）6H追加することができます。 </li><li>異なる網膜細胞型に対する治療の効果はBrn3a（神経節細胞のマーカー）またはオプシン（視細胞マーカー）およびDAPIで対比染色のようなニューロンに特異的な抗体によってcytospinsで可視化することができる。 </li></ol>パート7：代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1：マウスの器官型網膜wholemountsの準備のステップ と両眼を持つマウスの頭部。アップレンズ面とBネズミ目、まだ場所ですべてのレイヤー。視神経と裏面からCマウスの目はまだ接続されている。強膜と色素上皮部分的に削除されたとDネズミの目が。Eマウス網膜角膜、強膜と色素上皮は完全に削除されますが、まだ場所でのレンズと硝子体は、レンズと硝子体とFマウス網膜wholemountカップ除去。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="図2" /> 図2：サイトスピンやセクションによって器官網膜wholemount文化の分析 アポトーシスの分析については、解離細胞懸濁液のcytospinsはDAPIとpycnotic核で染色される核の断片化やクロマチンの凝縮（の矢印 ）で区別することができます。また、wholemountセクション（CE;マウス網膜生後（P）2）や網膜flatmount（F）は、TUNELアッセイに供し、DAPI（E）で対比染色することができます。異なる網膜細胞型に対する治療の効果は、神経節細胞マーカーBrn3a（Bの矢印 ）のようなニューロンに特異的な抗体によってcytospinsで可視化することができるGCL、神経節細胞層;。INL、将来の内顆粒層。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

解離、単分子層以上のマウス器官網膜wholemount文化2-5、retinospheroidまたは再集計された3D回転楕円体の培養神経細胞の相互作用との接続の保全1嘘、の利点は 、in vivo の状況で模倣した。旧レポート2〜比較して、私たちのビデオの記事では、網膜を損傷することなく、マウスの目とレンズと硝子体の除去を含む、さまざまな発育段階の網膜の解剖摘出...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

動物モデルの遺伝子と分析の対象とアブレーションは、入学する特定の網膜遺伝子機能のための古典的な戦略です。しかしながら、トランスジェニックは、網膜特異的またはコンディショナルノックアウトマウスモデルは、しばしば早期致死を表示したり、胎児や出生後早期の段階を超えて解析を防止する、深刻な奇形に苦しんでいます。 初代培養細胞は、外因的に適用される組換え因子、制御された環境での遺伝子やsiRNAによる遺伝子ノックダウンの過剰発現の影響を調べるための代替です。解離細胞の培養は、それによって薬理学的操作の後に外生的にトリガーの効果の識別を容易に、標的細胞に到達する内因性信号が低下するという利点があります。しかし、重要な細胞間相互作用は、最初に再集計されたretinospheroid文化1が使用されている場合でも、酵素消化または機械的な解離によって破壊されています。 これとは対照的に、器官型網膜wholemount文化が神経細胞の相互作用との接続はまだ保持さ2〜5で生体状況に近い生理的にシステムを提供しています。 このビデオの記事では、胚、生後および成体マウスの目の解剖の特殊性と神経の分析のため（2）解離とサイトスピン手順を含む器官網膜wholemountの文化のようなin vivoでの（1）設立のステップのデモンストレーションでステップを提供するアポトーシスと外因的に適用される組換え因子の存在下で培養した後、例えば器官wholemountsにおける網膜細胞の増殖、。

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

このビデオの記事では、器官型網膜wholemount文化や外因性誘導効果の分析のためのサイトスピン手順の確立を示しています。器官型網膜wholemount文化模倣体<em&gt; in vivoで</em&gt;状況と古典的なマウスの動物モデルの欠点を回避しながら大幅に実験操作のためのマウス網膜のアクセシビリティを促進する。

生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K ビュー.  University of Duisburg-Essen. このビデオの記事では、器官型網膜wholemount文化や外因性誘導効果の分析のためのサイトスピン手順の確立を示しています。器官型網膜wholemount文化模倣体 in vivoで状況と古典的なマウスの動物モデルの欠点を回避しながら大幅に実験操作のためのマウス網膜のアクセシビリティを促進する。

ビデオ: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

大人のウサギの網膜の器官培養

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

生物学

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18ラット脳の器官型スライス培養

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...