Para comenzar, coloque los moldes de micropocillos PDMS, la solución de enjuague antiadherente y el desgaste de laboratorio necesario en una campana de cultivo de tejidos. Para lavar los moldes de micropocillos de PDMS, utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir 300 microlitros de solución de enjuague antiadherente a cada pocillo. A continuación, centrifugar la placa, 1, 620 G durante tres minutos.
Utilice una bomba de vacío y una pipeta Pasteur para aspirar la solución. A continuación, coloque 500 microlitros de suspensión celular a la concentración deseada en los micropocillos y centrifugue la placa a 1, 620 G durante tres minutos. Coloque la placa en una incubadora humidificada para permitir la formación de esferoides.
Para cosechar los esferoides, con una pipeta de 1.000 microlitros, agregue firmemente 500 microlitros de medio completo en cada pocillo. Pipetee el medio agregado hacia arriba y hacia abajo en cada cuadrante tres o cuatro veces para desalojar los speroides. A continuación, utilice la pipeta para aspirar suavemente el medio que contiene los esferoides en un tubo de microcentrífuga.
Transfiera 50 microlitros de la suspensión de esteroides en un tubo de microcentrífuga. A continuación, añade secuencialmente acrilato PEG de 4 brazos y ditiol PEG. Mezcle la solución resultante pipeteándola hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces.
Para obtener 100 microlitros de una solución precursora de hidrogel PEG del 10% en peso por volumen, pipetee 20 microlitros de la solución precursora de gel entre dos portaobjetos de vidrio revestidos de parafilm separados con espaciadores de silicona de un milímetro e incube los portaobjetos con una solución precursora de gel para permitir la gelificación. Una vez que se complete la gelificación del hidrogel, con una espátula, retire suavemente los geles de los portaobjetos de vidrio separados. Coloque un gel por pocillo en una placa de 24 pocillos, asegurándose de que la superficie que contiene los esferoides quede hacia arriba.
Agregue 500 microlitros de medio completo a cada pocillo para sumergir el hidrogel por completo. Coloque la placa de pocillos múltiples en una incubadora humidificada para cultivar las células. La técnica descrita utilizando moldes de micropocillos dio como resultado la formación de esferoides con formas esféricas y polidispersidad estrictamente controlada.
Para los esferoides con 3.300 células por micropocillo, el tamaño medio del esferoide fue de unas 250 micras y la circularidad fue superior a 0,8, considerando un valor de 1 como esfera perfecta. Los diámetros de los esferoides dependían del tamaño del micropocillo y del número de células por micropocillo.
