Para empezar, la centrífuga tripsinió fibroblastos dérmicos humanos normales. Retire el sobrenadante del tubo centrífugo. Agregue medio DMEM bajo en glucosa precalentado y suplementado al pellet y mezcle bien para resuspenderlo.
Coloque los fibroblastos dérmicos humanos normales en una placa de cultivo de células adherentes de 10 centímetros. Agite suavemente el plato en sentido transversal. Después de 14 días de estimulación 2D, cuando las células se hayan vuelto confluentes, aspire el medio y use un raspador celular para separar suave y rápidamente la lámina celular formada de la placa.
Al mismo tiempo, enrolle la lámina celular en un organoide 3D similar a una varilla. Transfiera los organoides normales de fibroblastos dérmicos humanos a una placa de Petri no adherente de 10 centímetros de ancho. Mide el alargamiento con una regla.
Luego, sostenga un lado del organoide con una pinza y estire suavemente el organoide hasta que se haya alargado axialmente en aproximadamente un 10%Usando una pinza, presione manualmente los pasadores de metal a través de ambos bordes del organoide en el plato de plástico para fijarlo. Finalmente, para la maduración en 3D, agregue 10 mililitros de medio de alto contenido de glucosa DMEM suplementado precalentado antes de la incubación. La morfología macroscópica de los organoides 3D en los días cero y 14 de la etapa de maduración 3D mostró una apariencia blanca y brillante.
Con el tiempo, los organoides se contrajeron y aparecieron más densos. La morfología de los organoides se evaluó mediante tinción con H E. El primer día, los organoides mostraron capas inconexas, compuestas principalmente por células rodeadas por bajas cantidades de matriz.
Las células dentro de las capas exhibieron núcleos con forma redonda y tamaños variables. Al día 14, se observó un aumento notable en la señal de eosina, lo que indicó la deposición de la matriz y las capas fusionadas. Además, los organoides mostraron la presencia de áreas que contenían células alineadas.
La mayoría de los núcleos tenían tamaños similares y, en ocasiones, eran alargados.
