Después de cultivar células endoteliales en la placa de 96 pocillos, retírela de la incubadora y confirme la confluencia con un microscopio invertido. Coloque el plato en un fregadero para eliminar el medio completo y seque la parte superior del plato con una toalla de papel. Añada tampón de ensayo HBSS HEPES más solución de probenecid a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 mililitros.
Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a cada pocillo y deje reposar las células durante cinco minutos. A continuación, agite la placa para extraer el tampón de ensayo. Añada el tampón de descarga a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 mililitros independiente.
Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros del tampón de carga de colorante a cada pocillo de la placa de ensayo. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos. Después de la incubación, observe la placa bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar la absorción del colorante.
Agita la placa para eliminar la solución de tinte. Lave las células dos veces con 50 microlitros de tampón de ensayo HBSS HEPES más solución de probenecid en cada pocillo. Agite la placa para extraer el tampón de ensayo.
Agregue 92 microlitros de tampón de ensayo HBSS HEPES a cada pocillo y, nuevamente, observe las células con un microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el exceso de tinte se haya eliminado por completo y que las células permanezcan adheridas. Con una pipeta multicanal, agregue dos microlitros de las soluciones antagonistas y el vehículo a los pocillos apropiados. Después de encender el lector de placas, ajuste la temperatura a 37 grados centígrados e incube la placa durante 15 minutos.
Mida la fluorescencia de fondo en las columnas uno y dos, realizando cinco escaneos por pocillo. Expulse la placa del lector de placas, luego de una tira de PCR de 8 tubos, agregue rápidamente seis microlitros de solución agonista usando una pipeta multicanal a cada pocillo en las columnas uno y dos. Mide el cambio en la fluorescencia a medida que se produce la movilización de calcio en las células.
Realice 20 escaneos de cada pozo. El ensayo de movilización de calcio con células endoteliales demostró que los pocillos de control positivos sin antagonista mostraron un rápido aumento de la fluorescencia. Los pocillos con altas concentraciones de antagonistas mostraron un cambio mínimo en la fluorescencia, similar a los pocillos de control negativo sin agonista.
