Para comenzar, configure un microscopio fluorescente para obtener imágenes. Inserte un portaobjetos completamente teñido con secciones de tejido de inmunotinción. Una vez que se haya establecido el objetivo, presione el botón en vivo y luego concéntrese en la muestra.
Utilice el icono de escalado automático para evaluar si los canales están adecuadamente saturados de señal. Después de finalizar la configuración del microscopio, cargue el microscopio con los portaobjetos de control de un solo color. Concéntrese debajo de la muestra y presione la opción comenzar en el menú Z-Stack para comenzar a configurar un Z-Stack.
A continuación, concéntrese por encima de la muestra y pulse la opción finalizar. Para compensar la fluorescencia de las imágenes, abra una de las imágenes de control únicas. Observe las ventanas de escala de grises para cada canal en busca de una señal en un canal inapropiado.
Para eliminar el sangrado, introduzca manualmente los números en la matriz y, a continuación, pulse aplicar para comprobar si se ha eliminado adecuadamente. A continuación, ensamble todos los valores de cada control en una sola matriz. Aplique esta matriz a una muestra completamente teñida.
Inicie el software ilastik y abra el archivo tiff de los tejidos. Haga clic en la pestaña de entrenamiento, luego use la herramienta de pincel para resaltar celdas individuales en las imágenes. Asegúrese de resaltar las células de manera que se incluyan el interior y la membrana celular.
A continuación, use la etiqueta dos para resaltar todo lo que no sean las celdas de interés. Ahora inicie el software tres y abra una imagen IMS del tejido que contiene todas las tinciones fluorescentes. Elija la opción máscara sobre núcleos como canal de origen para la detección de núcleos.
A continuación, seleccione la opción avanzada para dividir los núcleos por puntos de semilla. Establezca un valor para el diámetro del núcleo. Examine la imagen en busca de varias células fusionadas o células faltantes.
A continuación, haga clic en el objeto de celdas creadas, seguido de la pestaña de creación, y luego en la opción almacenar parámetros para lotes para guardar la configuración de uso. Inicie Anaconda y, a continuación, inicie JupyterLab dentro de Anaconda. Abra el archivo de codificación complementaria 1, luego presione ejecutar todas las celdas o ejecutar las celdas seleccionadas en el menú de ejecución.
Cuando aparezca un mensaje, introduzca el directorio de archivos para los valores fluorescentes exportados. A continuación, introduzca el directorio de archivos de cualquier ubicación adecuada para guardar los archivos procesados. Ejecute la siguiente sección del código para anotar los datos con los nombres de cada canal.
Una vez que se establezca una estrategia de acceso, haga clic con el botón derecho en población en el menú, luego elija exportar. Exporte los parámetros como un archivo csv con los encabezados incluidos. Vuelva a iniciar JupyterLab en Anaconda.
A continuación, abra el script en el archivo de codificación complementaria 2 y ejecute el código. Cuando se le solicite que ingrese la ubicación del software para el archivo, ingrese el directorio de archivos de los archivos csv exportados. A continuación, cuando se le pida que agregue la ubicación de salida, elija un directorio de archivos de su elección y asegúrese de que el directorio de archivos incluya el nombre del archivo al final.
Ejecute el resto del código. Ahora copie el texto en un archivo txt y abra el archivo ims correspondiente en el software tres. Haga clic en el objeto de celda en el archivo.
Cambie a la pestaña de estadísticas, luego pegue el texto en la barra de búsqueda y comience la búsqueda. Ahora se resaltarán todas las celdas de interés. Los colorantes fluorescentes superpuestos espectralmente se separaron eficazmente en el tejido que se tiñó con múltiples colorantes.
La separación de los tintes diferenció claramente los diferentes tipos de células en el tejido linfático. Se utilizó el aprendizaje automático definido por el usuario para separar las celdas incluso cuando estaban muy compactas.
