Para comenzar, coloque los trofozoítos congelados de Naegleria gruberi a 37 grados centígrados durante tres minutos. Cultive los trofozoítos en medios PYNFH a 25 grados Celsius hasta aproximadamente un 80% de confluentes. Coloque el matraz confluente en hielo durante cinco a 10 minutos para liberar los trofozoítos adheridos del plástico.
A continuación, agite suavemente el matraz para desalojar las células adherentes restantes. Reemplace el medio con medio de enquistamiento estéril para enquistar las células de Naegleria gruberi. Después de 48 horas, retire los quistes del matraz.
Centrifugar los quistes a 600 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los quistes en dos mililitros de medio PYNFH con un 10% de suero de ternera fetal para excysar las células. Incubar los quistes a 25 grados centígrados durante 72 horas hasta que emerjan los trofozoítos y alcancen el 80% de confluencia.
Para transfectar los trofozoítos, primero coloque un mililitro de los trofozoítos en una placa de cultivo de tejido de fondo plano de seis pocillos. A continuación, incube la mezcla de reactivos de transfección de plásmidos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Pipetear aproximadamente 800 microlitros de medio de las monocapas de trofozoítos justo antes de la transfección.
A continuación, añada 200 microlitros de la mezcla de reactivos de transfección de plásmidos a los trofozoítos. Gire suavemente la placa cada 15 minutos para evitar que los medios se agreguen en los bordes de la placa y se sequen. Después de una hora, agregue 10 unidades de DNasa en un mililitro de tampón de DNasa 10X y agréguelo a los pocillos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos para eliminar el ADN plasmídico residual. Ahora lave el plato una vez con un mililitro de medio de crecimiento, luego agregue dos mililitros de medio fresco. Incubar la placa a 25 grados centígrados durante 24 a 36 horas.
Cuando se complete la incubación, divida el contenido de un pocillo en una placa nueva en una proporción de 1:2. A continuación, recoja los trofozoítos de los pozos restantes para su posterior análisis. Los trofozoítos de Naegleria gruberi fueron ameboides y adherentes a los matraces de cultivo en condiciones de cultivo estándar.
Su incubación en hielo dio como resultado trofozoítos redondos y no adherentes. La incubación de los trofozoítos en medios de enquistamiento hizo que se enquistaran.
