작품은 Helse OG Rehabilitering (JLB), 노르웨이 연구위원회 (GH 및 JCG)와 오슬로의 대학 (NK과 JCG)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 배아로 분리 및 인간 줄기 세포 및 사출을위한 준비의 문화 <ol><li> 이 프로토콜의 예입니다 (뇌, 지방, 골수)로 사용 인간 줄기 세포는 다른 조직에서 여러 가지 방법으로 격리됩니다. 예를 들어, 성인 신경 줄기 세포는 체외에서 교양있는 개별 셀에 다음 dissociated 아르 내시경 신경 외과, 동안 두뇌의 심실 벽에서 수집한 조직 조각에서 격리됩니다. 신경 줄기 세포는 저절로 다른 세포 유형 접시 7 바닥을 준수하면서 문화 매체 부동 neurospheres를 형성하고 있습니다. 지방 - 유래 mesenchymal 줄기 세포는 효소 소화와 섬유 조직을 제거하기 위해 긴장하고 성숙 adipocytes을 제거하는 centrifuged는 지방 흡입 자료에서 얻을 수 있습니다. 그 결과 세포는 다른 세포 유형을 통해 8 조혈 줄기 및 전구 세포가 자기 입자 (Myltenyi Biotec, 독일 복합 특정 항체를 사용하여 긍정적인 선택에 의해 골수 aspirates으로부터 격리 수있는 줄기 세포의 확산을 촉진하기 위해 혈청과 보완 문화 매체 resuspended 아르 또는 Dynal - Invitrogen, 미국)과 자기 세포 분리 및 / 또는 fluorophores 및 형광 활성 세포 분류 (외과) 9 복합 항체를 사용하여. </li><li> 닭 배아에 주입 이전에 형광 표시와 함께 나중에 식별, 라벨 줄기 세포를 촉진합니다. 줄기 세포는 곧 주입하기 전에, 또는 오염 호스트 세포의 기본적없이 위험 영구 라벨, 최대 공급자 권장 프로토콜을 사용하여 이러한 DiI (Invitrogen, 미국) 또는 PKH26 같은 형광 lipophilic 염료 (시그마, 미국)와 함께 표시됩니다 그들은 여전히 문화 10 동안 lentiviral 벡터를 사용하여 그린 형광 단백질과 같은 형광 단백질에 대한 유전자와 transduced 수 있습니다. </li><li> 인간 줄기 세포의 문화와 전파를위한 프로토콜이 다릅니다. 자세한 프로토콜은 문헌에서 찾을 수 있습니다. 자기편 줄기 세포는 일반적으로 배양 접시에 양식 반면 간단히, 영역 - 성형 줄기 세포는 일반적으로 적절한 매체 (분할은 아래를 참고하면 분쇄를 용이하게하는), flasks에서 양식입니다. 분할 또는 수확 들어, 펠릿 영역 - 성형 37도 섭씨에서 더 이상 5 분 이상 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 1200rpm과 resuspend에서 5 분 원심 분리하여 세포를. 자기편 세포 배양 접시에 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가로 5 분 거리의 끝 부분에 씹다하십시오. 때로는 알부민을 구비 매체, + 함유 칼슘 2 추가하여 trypsinization을 종료할 수 있습니다. , 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 제거 세포 (1200rpm에서 5 분) 원심 분리기하려면 (일반적으로 중간 또는 생리 인산염 버퍼) 차가운 주입 차량에 resuspend, 뜨는을 제거하고, (1200rpm에서 5 분) 다시 원심 분리기. 이 뜨는의 대부분을 제거하고 부드럽게 고농도 세포 현탁액을 만드는 세포를 resuspend. </li><li> 최대 몇 시간 이전에 분사하는 얼음에 작은 덮인 유리병 또는 microfuge 관에서 인간 줄기 세포의 정지 보관하십시오. 이 상태에서 생존은 세포 종류에 의존 수 있습니다. 사출 차량들은 adhesivity (예 : 낮은 칼슘 2 + 차량 clumping 방지 도움이 될 수 있습니다) 및 hypoxia와 pH의 변화에 대한 저항을 포함하여 세포의 특성에 따라 최적화되어야합니다. </li></ol> 2. 달걀 부화 및 준비 <ol><li> ° C 이전의 부화에 14-15에서 : 저장소가 냉각 챔버 (Termaks, 베르겐, 노르웨이, 예를 들어)에 계란을 수정된. 부화가 시작 때까지이 온도 개발에 체포됩니다. 약 10 일 이상이나 낮은 온도에서 저장 수정된 난자는 이후 개발 및 생존의 낮은 비율을했습니다. </li><li> 개발의 원하는 무대가 (준비를 위해 도달할 때까지 심판을 볼 수 38-39시 ° C, 그리고 부화 11 : 개발을 reinitiate하려면, humidified, 강제 통풍 인큐베이터 (바인더, 뉴욕, 미국 예를 들어)에 계란을 넣으십시오. ). </li><li> 계란을 열기 전에 (그림) 난각 (너무 깊이 노른자를 피어싱 피하기 위해)를 통해 18 게이지 주사 바늘을 삽입하고 알부민 4 ML 철수하여 배아 위의 공기 주머니를 만듭니다. 이것은 몇 분 이내에 다공성 껍질을 통해 공기의 항목이 같도록하는 압력 강하를 만듭니다. 공기가 들어가는 것처럼 따라서 껍질의 내부 표면에서 배아를 분리, 셀 내에서 가장 높은 지점에서 수집합니다. </li><li> 기존의 플라스틱 테이프로 주사 바늘에 의해 만들어진 구멍을 밀봉합니다. </li></ol> 3. 유리 micropipettes 당기는 <ol><li> borosilicate 유리 유리 micropipettes를 당겨 (예를 들어, 1.2mm OD X 0.94 mm ID를, 하버드 장치, 미국) 종래의 전극 풀러에서 (예를 들어, 모델 P - 2000, 셔터 인 스트 루먼트, 미국). microel로 사용하면 높은 입력 저항을 micropipettes를 얻을 풀러 설정을 조정합니다ectrodes. 팁은 약 1-1.5 cm 길이되어야합니다. 통로가 나옵 볼륨을 계산하는 1mm 간격으로 표시되어 있습니다. </li><li> 포셉 그들을 굽힘이나 현미경으로 보는 동안 고체 표면에 대한 그들을 밀고하여 가능한 크기로 micropipette 도움말 브레이크. 휴식은 유리의 주위로서 가능한되어야하며 끝에 표시된 내경은 막힌받지 않고 사용할 수있는 세포의 크기를 수용해야합니다. 일반적으로 20-30 마이크론 내경은 잘 작동합니다. </li></ol> 4. 빠른 그린 염료 솔루션 (대조 시약)의 준비 <ol><li> (137 MM NaCl, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 1 MM 닭 생리 식염수에 용해하여 빠른 그린 염료 (시그마 - 알드리치, 미국)의 0.1 % (W / V) 솔루션을 준비 나 - 인산염, 5 MM의 HEPES, 11 MM 포도당, 산도 7.4). </li><li> 0.22 μm의 Millex GP 필터 (Millipore (주), 베드 포드, 미국)를 통해 빠른 그린 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> 5. 달걀을 열고 배아를 대조 <ol><li> 공기 주머니의 크기를 덮고, 계란의 상단에있는 테이프의 두 가지를 놓습니다. 계란이 지향 유지할 수있다는 것은 그래서 녹화 면적 (그리고 따라서 공기 주머니)가 자리잡은 것을, 튼튼한 해부 가위를 사용하여 테이프 영역의 경계 내에있는 작은 창문을 했네요. 테이프 지원을 추가하고 배아에 떨어지지 달걀 껍질 조각을 방지하는 데 도움이됩니다. 공기 주머니와 관련된 공기 방울은 플라스틱 피펫 팁 또는 다른 날이 프로브의 백 엔드를 사용하여 쐈고 수 있습니다. </li><li> 25 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 몇몇 빠른 그린 솔루션을 그립니다. 주사기와 바늘에 공기 방울을 제거합니다. 45도 각도로 바늘을 구부, 배아 접시 (그것을 주위에 경계선을 긋다 혈관의 반지로 식별하고, 배아 판 증가 사망률 이내 피어싱) 이외의 지점에 침투하고 조심스럽게 배아에서 뜨개질을지도. 원하는 콘트라스트를 얻을 때까지 염료를 주사. 일반적으로 투명 배아는 이제 어두운 녹색 색상 (그림 B)에 대한 약간 흰 유령으로 눈에 띄는 것입니다. 많은 조사는 인도 잉크 (10 % V / V로 희석) 대신 빠른 그린을 사용합니다. 이 경우에는 Pelikan 파운트 인도 잉크 같은 비 - 독성 인도 잉크를 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 6. hindbrain 및 척수 신경 튜브 병변 만들기 <ol><li> 에 의해 날카롭게 텅스텐 바늘을 생산 불꽃 - 에칭 아세틸렌 / 산소 토치로, 100 μm의 직경의 텅스텐 막대 (카탈로그 번호 719000, A &amp; R 시스템, 시애틀, 워싱턴)의 짧은 (2-3 ㎝) 조각. 이것은 날카로운 팁을 남겨두고, 텅스텐의 바깥쪽 레이어의 폭발 침식을 상징하는 불꽃이, 볼 때까지 토치 화염으로 매우 간단히 막대의 끝을 삽입하여 이루어집니다. </li><li> 을 통해 날카롭게 텅스텐 바늘, 슬라이스를 사용하여 미세을위한 지역을 덮고있는 vitelline 멤브레인 비켜. </li><li> 두 번째 날카롭게 텅스텐 바늘 (첫 번째 바늘 끝이 자주 vitelline 막 통해 깔끔히 후 손상 이후 미세에 적합하지 않습니다)를 사용하여 신경 튜브를 overlying 상피를 통해 신중하게 잘라 그것을 비켜 다음, 주위를 잘라 조각 미만 신경 튜브의 짧은 빠른 상향 스트로크 (그림 C)를 사용하여 제거할 수 있습니다. 세로 인하 후 가로 인하가 먼저 만드는 것이 일반적으로 가장 성공적인 것입니다. 심하게하지 마십시오 또는 일반적으로 치명적인 관통 기본 혈관을 위험. </li><li> 부드럽게 플립이나 떨어진 텅스텐 바늘을 사용하여 병변 사이트에서 resected 조직 조각을 끕니다. 이 어려운 증명한다면, 그것은 또한 유연한 튜브에 부착된 유리 micropipette를 사용하여 입 흡입하여 제거할 수 있습니다. </li></ol> 7. 인간 줄기 세포의 주입 A. 신경 튜브의 병변에 주사 플라스틱 튜브를 사용하여 입 흡입하여 유리 micropipette의 일각으로 세포의 작은 금액을 그립니다. 세포 현탁액의 작업 농도는 주입되는 세포 유형에 대한 최적화해야합니다. micromanipulator에 micropipette를 탑재하고 microinjector 펌프 (예 : PV830 공압 PicoPump, WPI, 워싱턴, 미국)에 연결합니다. 해부 현미경을 사용하여 시각적인 통제, 병변에 micropipette 팁 안내 조심스럽게 공기 압력 (중 일정한 압력의 펄스 또는 점차 압력을 끌어 올렸하여) (그림 C)을 증가시켜 세포를 추방. 세포의 원하는 금액이 병변 사이트 내에서 입금하면 신중하게 micropipette를 철회. B. 신경 튜브의 루멘에 분사 세포 병변의 부재에있는 신경 조직에 대한 액세스 권한을 얻을 정도로 침입하는 경우 어떤 경우에는 그것은 예를 들어, 개발 뇌 심실에 세포를 주입하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 모든 BR의 루멘에 세포의 주입당연히 지역 루멘가 큰만큼 소켓을 제공하며 쉽게 접근하는에서 발달 단계를 사용하여 필요, HH 스테이지은 12 18이 점에서 유리한 있습니다. 병변은 필요하지 않습니다. 간단히 피어스 신경 튜브 전에 세포의 주입에 유리 micropipette로의 벽. 이 방법의 성공을 위해 중요한 요소는 micropipette와 침투의 종결의 선명도되며 너무 움직임을 느리게하고 micropipette 팁은 관통하지 않고 신경 튜브 벽 딥플 수 있습니다. C. 체계적 주사 체계적 주사는 (이러한 혈관이 잘 개발 HH 단계 15 일부터 시작) 엑스트라 배아 혈관을 통해 만들 수 있습니다. 이것은 쓰시 출혈과 함께 많은 작은 동맥과 적은 큰 혈관이 있기 때문에 그것이 배아의 생존에 올 때, 내부 동맥 주사는 일반적으로 안전하지 않습니다. 한편, 정맥 주사 따라서 아마도 세포의 이상도 배포를 심장에 세포의 빠른 액세스를 제공합니다. 성공적인 주입은 대상 선박보다 작은 직경을 가진 날카로운 micropipette이 필요합니다. (약 30도) 수평에서 작은 각도의 축을 따라 선박에 접근한다. 선박은 막다 시작 때까지 선박에 대한 micropipette 밀어. 그런 다음에 침투하는 회사, 갑작스러운 운동에 더 밀어. 혈액 micropipette의 일각으로 모세관 현상에 의해 그려 볼 때까지 천천히 철회. 세포의 주입은 다음 micropipette가 빠른 운동과 철회하는 후, 일정한 압력을 사용하여 수행되어야합니다. 8. 계란을 밀봉 <ol><li> 주사 후, 계란이 주입된 세포가 정착하고 준수하도록 몇 분 동안 가만히 보자. (빨리 발생할 수 있으며, 치명적인 증명할 수있는) 탈수를 방지하려면 한 조각이 휴식 기간 동안 창을 통해 조직이나 필터 종이 moistened하다. </li><li> 몇 분 세포가 정착되면 창 주변의 껍질을 건조하고 기존의 플라스틱 테이프로 창문을 밀봉. 이 도장이 꽉이며 알부민가 시작이나 껍질 테이프 (이것은 종종 이후 부화하는 동안 치명적인 증명) 사이의 누설 수 없습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 발전을위한 강제 통풍 인큐베이터에 달걀을 바꿉니다. 관찰은 창의를 통해 테이프를 제거하여 간격으로 만들 수 있습니다. </li></ol> 9. 배아 해부 <ol><li> 일단 배아가 원하는 단계에 도달했습니다, 얼음처럼 차가운 생리 식염수 또는 인산염 버퍼 호수 (창문을 덮고있는 테이프가 별도로 달걀 껍질의 두 반쪽을 허용 최초로 절단한다.)의 그릇에 계란을 깨서 얼음처럼 차가운 호수가 저체온증으로 배아를 마취하는 역할을합니다. 심장이 빠르게 속도와 몇 분 이내에 정지한다. </li><li> extraembryonic 점막에서 배아를 분리하고 심판을 사용하여 그것을 무대. 11. </li><li> 실리콘 고무 층을 가지고 있으며, 포도당 (137 MM NaCl, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 1 ㎜ 나 인산, 5 보충 산소 생리 식염수가 들어있는 해부 접시에 전송, 배아 목을 벨 MM의 HEPES, 11 MM 포도당, 산도 7.4)와 빠른 복부 쪽을 핀. 복부와 흉부 내장을 제거합니다. 직각 가위를 사용하여 척추 열의 각 ventrolateral 측면을 따라 세로 incisions합니다. 특히 나중에 단계 (발전 6 일 후)에, 초기 절개는 가장 척추와 척수 사이의 공간이 가장입니다 lumbosacral 지역에서 이루어집니다. 척수를 공개 척추 열의 복부 측면을 제거합니다. 생리 식염 순수 의료 산소와 약 10 분 간격으로 버블링에 의해 산소 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 신중하게, 양쪽에 초기 지느러미와 복부 뿌리를 잘라 원하는 수준에서 척수를 가로로 쪼개다, 부드럽게 척추 운하의 그것을 밖으로 리프트. 척수는이 상태에서 몇 시간 동안 생존하고 해부학 12 생리학 13,14 실험의 대상이 될 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="그림 1" /> 알부민의 피난을위한 그림 1.) 적절한 접근. 배아의 위치와 바늘의 위치를​​ 적어 둡니다. B) 배 (胚)의 대조. 배아 디스크 밖 바늘의 침투 지점을 확인합니다. C) 일방적 척추 신경 관 병변에 대한 프로 시저의 도식 표현은 세포 이식에 의해 따랐다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

닭 배아는 xenotransplantation 실험을위한 편리하고 다양한 동물 모델입니다. 배아와 태아 발달 동안 기능 면역 시스템의 부족은 배양 온도를 허용하는 종 세포의 생존과 발전을 수 있습니다. 치킨 배아는 줄기 세포 (심판의 검토. 15) 다양한 종류의 재생 가능성을 테스트하는 데 사용되었습니다. 포유 동물의 줄기 세포들이 그의 axonal 계획 뉴런을 야기할 수있는 중추 신경계를 포함한 닭고기 배아 조직에 통합할 수, 시냅스 연결과 electrophysiological 특성 기능 신경 회로 1,2의 맥락에서 평가하실 수 있습니다. 수술 절차가 비교적 간단하고, 주사 대신 stereotaxic 컨트롤의 시각적하에 만들어진 때문에 배아의 수를 쉽게 하나의 실험 이내에 다른 실험 조건을 수용하기 위해 증가 수 있습니다. 일반적으로 세포는 4 시간 이내에 실험 20-30 배아에 주입 수 있습니다. 배아의 사후 분사 사망률은 주요 제한 요소입니다. 주의 사항은 출혈과 탈수를 피하기 위해 이동해야합니다. 에서 자연 사망률 증가 특정 중요한 발달 단계가있다는 것을 인식한다. 따뜻하고 멸균 치킨 울리는 다음 주입하고 중요한 발달 단계 전날 몇 ML으로 배아를 보완뿐 아니라 계란의 창, 누설을 피하기 위해 잘 밀봉하고 중심이다 생존을 향상 있도록. 테이프 봉인을 통해 누수가 발생된다면, 테이프를 제거 표면 다시 테이프를 건조. 일부 수사관들은 창문을 봉인하기 위해 왁스, 유리 또는 플라스틱 coverslips를 사용합니다. 사망률은 가짜 운항 배아 대 주입에 실질적으로 다를해서는 안됩니다. 우리는 두뇌 및 척수의 anlage에 인간 줄기 세포의 주입에 여기에 초점을 맞추고 있지만, 줄기 세포가 다른 장기의 anlage (예 : 심판에 대한 참조하십시오. 4)로 주입 수 있습니다. 각 기관이 자체적으로 도전 포즈. 예를 들어, 심장에 주사 때문에 섹스를 피펫으로 높은 기계적 저항 때문에 반면에 주입하기 전에 실내 온도에 배아를 냉각에 의해 느려질 수있는 운동의 도전하실 수 있습니다. 루멘 부족 기관은 충분한 볼륨의 주입을 수용하지 않을 수 있습니다 따라서 소켓을 만들 외과 병변이 필요할 수 있습니다. 그것이 조직에 인간 줄기 세포의 통합을 촉진하기 때문에 우리의 경험에서 사후 병변 조직 재생이 장점이다. 전지는 또한 신경 크레스트 - 파생 주변 신경 16,17 포함한 mesenchymal 유도체로 정관를 달성하기위한 방법으로 분산 somitic mesenchyme 또는 마이 그 레이션하는 신경 문장으로 배아 mesenchyme에 주입 수 있습니다.

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<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

닭 배아는 표준에서 세포의 행동을 연구하기 위해 정상적인 배아와 태아의 개발 연구 및 xenotransplantation 실험에 대한 고전적인 동물 모델입니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 환경. 닭 배아의 주요 장점은 저렴한 비용, 높은 접근성, 수술 조작의 용이성과 완벽하게 개발된 면역 체계의 부족을 포함합니다. 닭 배아에 Xenotransplantation는 세포 증식, 분화 및 행동, 정의 배아 조직 틈새에서 신호 세포의 반응, 그리고 tumorigenic 가능성에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 닭 배아에 세포를 이식하면 다른 동물 모델에 이식 실험을 향해 한 걸음 수 있습니다. 최근 닭 배아는 신경 anlage에 주입 다음과 같은 인간의 줄기 및 전구 세포의 neurogenic 잠재력을 평가하는 데 사용되었습니다<sup&gt; 1-6</sup&gt;. 이 비디오에서 우리는 닭 배아의 발전 중추 신경계에 인간 줄기 세포를 이식에 대한 모든 절차를 문서화. 원하는 시대의 배아가 개발한 때까지 절차는 수정된 알을 부화와 함께 시작합니다. 달걀 껍질은 다음 개설하고, 난자는 배아와 노른자 사이에 염료를 주입하여 대조됩니다. 작은 병변은 호스트 조직으로 후속 통합을 촉진 세포 증착을위한 재생 사이트를 만들고, 미세를 사용하여 신경 튜브에 만들어집니다. 우리는 hindbrain 및 척수를 형성하고, 두뇌를 형성 신경 튜브의 부분 루멘에 신경 튜브의 부분에서 만들어진 이러한 병변에 인간 줄기 세포의 주사를 보여줍니다. extraembryonic 정맥과 동맥에 체계적 주사도 중추 신경계를 포함한 vascularized 조직에 세포를 전달하기 위해 다른 방법으로 증명하고 있습니다. 마지막으로 우리는 앞으로의 개발 며칠 후 난자에서 배아를 제거하는 방법 및 그 이후의 생리, histological 또는 생화학 분석을위한 무료 척수를 해부하다하는 방법을 보여줍니다.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

본 논문에서 우리는 닭 배아의 중추 신경계의 여러 지역으로 인간의 줄기 세포를 이식하는 방법을 제시. 이것은을 제공합니다<em&gt; 생체내에</em배아 조직 환경에서 인간 줄기 세포의 다양한 유형의 확산과 차별을 평가하기위한&gt; 모델입니다.

치킨의 배아에 인간 줄기 세포의 Xenotransplantation

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

xenotransplantation-of-human-stem-cells-into-the-chicken-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

19.2K 조회수.  University of Oslo. 본 논문에서 우리는 닭 배아의 중추 신경계의 여러 지역으로 인간의 줄기 세포를 이식하는 방법을 제시. 이것은을 제공합니다 생체내에 모델입니다.

비디오: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

연구

생물학

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

인간 신경 줄기 세포를 계산

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

형질 전환의 세대<em&gt; 히드라</em&gt; 배아 미세 주입에 의해

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.