Le travail a été soutenu par des subventions de Helse og rehabilitering (JLB), le Norvégien Research Council (GH et JCG) et l&#39;Université d&#39;Oslo (NK et JCG).

1. Isolement et culture des cellules souches humaines et la préparation pour injection dans des embryons <ol><li> Les cellules souches humaines utilisées comme exemples dans ce protocole (cerveau, tissu adipeux de la moelle osseuse), sont isolés de différentes façons à partir des tissus différents. Par exemple, cellules souches neurales adultes sont isolées à partir de morceaux de tissus prélevés sur la paroi ventriculaire du cerveau pendant la neurochirurgie endoscopique, qui sont ensuite dissociés des cellules individuelles qui sont cultivées in vitro. Les cellules souches neurales forment spontanément des neurosphères qui flottent dans le milieu de culture tout autres types de cellules adhèrent au fond du plat 7. Adipeuses cellules souches mésenchymateuses sont obtenus à partir de matériaux liposuccion qui est une digestion enzymatique et tendues pour enlever le tissu fibreux et ensuite centrifugé pour éliminer les adipocytes matures. Les cellules obtenues sont remises en suspension dans un milieu de culture supplémenté avec du sérum pour promouvoir la prolifération des cellules souches sur d&#39;autres types cellulaires 8 souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices peuvent être isolés à partir des aspirations de moelle osseuse par sélection positive en utilisant des anticorps spécifiques conjugués à des particules magnétiques (Myltenyi Biotec, Allemagne ou de Dynal-Invitrogen, USA) et la séparation magnétique de cellules, et / ou en utilisant des anticorps conjugués à des fluorophores et la fluorescence de tri cellulaire (FACS) 9. </li><li> Afin de faciliter une identification ultérieure, l&#39;étiquette des cellules souches avec un marqueur fluorescent avant l&#39;implantation dans des embryons de poulet. Les cellules souches peuvent être étiquetés avec les colorants lipophiles fluorescents tels que DII (Invitrogen, USA) ou PKH26 (Sigma, USA) en utilisant le fournisseur recommandé par les protocoles jusqu&#39;à peu de temps avant l&#39;implantation, ou, pour une étiquette permanente avec essentiellement aucun danger de contamination des cellules hôtes, ils peuvent être transduits avec le gène codant pour une protéine fluorescente comme la Green Fluorescent Protein, en utilisant des vecteurs lentiviraux, tout en restant dans la culture 10. </li><li> Protocoles pour la culture et la propagation des cellules souches humaines varient. Des protocoles détaillés peuvent être trouvés dans la littérature. Brièvement, les cellules souches sphère formant sont généralement cultivés dans des flacons, alors que les cellules souches adhérentes sont généralement cultivées dans des boîtes de Pétri (qui facilitent la trituration lors du partage, voir ci-dessous), en milieu approprié. Pour le fractionnement ou la récolte, granulés sphère formant des cellules par centrifugation 5 min à 1200rpm et remettre en suspension dans préchauffé trypsine / EDTA solution pour pas plus de 5 minutes à 37 degrés Celsius. Pour ajouter des cellules adhérentes de la solution de trypsine / EDTA à la boîte de Pétri, puis triturer au bout de 5 minutes. Terminer la trypsination en ajoutant Ca 2 + milieu contenant, parfois complétée par de l&#39;albumine. Pour enlever la trypsine / EDTA, centrifuger les cellules (5 min à 1200rpm), éliminer le surnageant, remettre en suspension dans des véhicules d&#39;injection à froid (généralement à moyen ou un tampon phosphate salin), et centrifuger à nouveau (5 min à 1200rpm). Enlever la plupart de ce surnageant et remettre les cellules en douceur pour créer une suspension de cellules hautement concentré. </li><li> Gardez la suspension de cellules souches humaines dans un petit flacon bouché ou tube de micro sur la glace pendant plusieurs heures avant l&#39;injection. La survie dans cet état peut être de type cellule-dépendant. Le véhicule d&#39;injection doit être optimisé en fonction des propriétés des cellules, y compris leur adhésivité (par exemple un véhicule à basse Ca 2 + peut aider à prévenir l&#39;agglutination) et la résistance aux changements de l&#39;hypoxie et le pH. </li></ol> 2. Incubation des oeufs et de la préparation <ol><li> Boutique oeufs fécondés dans une chambre de refroidissement (par exemple: Termaks, Bergen, Norvège) à 14-15 ° C avant l&#39;incubation. A cette évolution de la température est arrêté jusqu&#39;au début de l&#39;incubation. Les oeufs fécondés stockés pendant plus de 10 jours ou à basse température ont un taux inférieur de développement ultérieur et la survie. </li><li> Pour relancer le développement, placer les oeufs dans un incubateur humidifié, forcé incubateur projet (par exemple: Binder, New York, USA) à 38-39 ° C, et incuber jusqu&#39;au stade de développement souhaité est atteint (pour la stadification, voir réf 11. ). </li><li> Avant l&#39;ouverture de l&#39;œuf, créer une poche d&#39;air au-dessus de l&#39;embryon en insérant une aiguille 18 gauge seringue à travers la coquille d&#39;oeuf (pas trop profondément pour éviter de percer le jaune) et d&#39;évacuer 4 ml d&#39;albumine (figure A). Cela crée une chute de pression qui en quelques minutes est égalisé par l&#39;entrée d&#39;air à travers la coquille poreuse. Comme l&#39;air pénètre qu&#39;elle recueille au plus haut point dans la coquille, séparant ainsi l&#39;embryon de la surface interne de la coquille. </li><li> Sceller le trou créé par l&#39;aiguille de la seringue avec du ruban de plastique conventionnels. </li></ol> 3. Tirer micropipettes de verre <ol><li> Tirez micropipettes de verre de borosilicate (par exemple, 1,2 mm x 0,94 OD mm ID, Harvard Apparatus, USA) sur un extracteur électrode classique (par exemple, le modèle P-2000, Sutter Instruments, USA). Réglez les paramètres extracteur d&#39;obtenir micropipettes qui ont une résistance d&#39;entrée élevée lorsqu&#39;il est utilisé comme microelectrodes. Conseils devrait être d&#39;environ 1-1,5 cm de long. Les arbres peuvent être marqués à intervalles de 1 mm pour le calcul des volumes éjectés. </li><li> Cassez les conseils micropipette à une dimension raisonnable en les pliant avec un forceps ou les poussant contre une surface solide tout en regardant sous un microscope. La rupture doit être aussi uniforme que possible autour du périmètre de la vitre et le diamètre intérieur résultante à la pointe doit s&#39;adapter à la taille des cellules pour être utilisé sans se bouche. Typiquement un diamètre de 20 à 30 microns intérieur fonctionne bien. </li></ol> 4. Préparation de la solution de colorant vert rapide (réactif contrastées) <ol><li> Préparer une solution à 0,1% (p / v) de Fast Green colorant (Sigma-Aldrich, USA) en dissolvant dans une solution saline physiologique de poulet (137 mM NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na- phosphate, 5 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4). </li><li> Filtrer la solution Fast Green à travers un filtre de 0,22 um Millex GP (Millipore Co., Bedford, USA). </li></ol> 5. Ouverture des œufs et contrastées de l&#39;embryon <ol><li> Placez deux morceaux de ruban adhésif sur le dessus de l&#39;oeuf, couvrant les dimensions de la poche d&#39;air. Garder les oeufs orienté de sorte que la zone enregistrée (et donc la poche d&#39;air) est la plus élevée, couper une petite fenêtre à l&#39;intérieur de la zone de scellés à l&#39;aide des ciseaux de dissection robuste. Le ruban ajoute le support et aide à prévenir des fragments de coquilles de tomber sur l&#39;embryon. Les bulles d&#39;air associé à la poche d&#39;air peut être sauté en utilisant l&#39;extrémité arrière d&#39;une pipette en plastique ou autres sonde mousse. </li><li> Dessinez une solution Fast Green dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 25. Retirer les bulles d&#39;air dans la seringue et l&#39;aiguille. Plier l&#39;aiguille à un angle de 45 degrés, pénètrent à un point hors de la plaque embryonnaire (identifié par l&#39;anneau de vaisseaux sanguins qui la circonscrire; percer dans la plaque augmente la mortalité embryonnaire) et soigneusement guider l&#39;aiguille dans l&#39;embryon. Injectez le colorant jusqu&#39;à ce contraste désiré est atteint. L&#39;embryon, qui est normalement transparent, devrait maintenant se démarquer comme un fantôme blanchâtre sur la couleur vert foncé (figure B). De nombreux chercheurs utilisent l&#39;encre de Chine (dilué à 10% v / v) au lieu de vert rapide. Dans ce cas, il est important d&#39;utiliser l&#39;encre de Chine qui est non-toxique, tels que l&#39;Inde Fount Pelikan Encre. </li></ol> 6. Faire cerveau postérieur et lésions de la moelle épinière du tube neural <ol><li> Produire des aiguilles de tungstène aiguisée par la flamme-gravure courte (2-3 cm) de 100 um de diamètre tige de tungstène (719000, numéro de catalogue A &amp; R Systems, Seattle, Washington), avec une torche à acétylène / oxygène. Cela se fait en insérant l&#39;extrémité de la tige très brièvement dans la flamme du chalumeau jusqu&#39;à ce qu&#39;une étincelle est vu, ce qui représente l&#39;érosion explosive des couches extérieures de tungstène, laissant derrière lui une pointe acérée. </li><li> En utilisant une aiguille aiguisée de tungstène, fendre et dévier la membrane vitelline couvrant la zone pour la microchirurgie. </li><li> En utilisant une aiguille de tungstène seconde aiguisé (le bout de la première aiguille est souvent endommagée après tranchage à travers la membrane vitelline et impropres à la microchirurgie ultérieures), couper soigneusement à travers l&#39;épithélium recouvrant le tube neural et le dévier, puis coupez autour et sous la pièce du tube neural à être retiré, en utilisant courts, rapides coups vers le haut (Figure C). Faire des coupes transversales d&#39;abord, puis les coupes longitudinales est généralement le plus de succès. Ne pas couper trop profondément ou vous risquez de pénétrer les vaisseaux sanguins sous-jacents, qui est généralement mortelle. </li><li> Doucement flip ou faites glisser le morceau de tissu réséqué loin du site de la lésion en utilisant l&#39;aiguille de tungstène. Si cela s&#39;avère difficile, il peut également être retiré par aspiration la bouche à l&#39;aide d&#39;une micropipette de verre attaché au tuyau flexible. </li></ol> 7. L&#39;injection de cellules souches humaines a. L&#39;injection dans une lésion du tube neural Dessinez une petite quantité de cellules dans la pointe d&#39;une micropipette de verre par aspiration la bouche en utilisant un tube en plastique. La concentration de travail de la suspension cellulaire doit être optimisé pour le type de cellules à injecter. Montez la micropipette sur un micromanipulateur et le connecter à une pompe microinjecteur (par exemple: PV830 PicoPump pneumatique, WPI, Washington, USA). Sous contrôle visuel à l&#39;aide d&#39;un microscope de dissection, guide la pointe micropipette dans la lésion et soigneusement expulser les cellules en augmentant la pression d&#39;air (soit par des impulsions de pression constante ou en montée en puissance progressive de la pression) (Figure C). Lorsque la quantité désirée de cellules est déposé dans le site de la lésion, soigneusement retirer la micropipette. b. L&#39;injection dans le lumen du tube neural Dans certains cas il peut être souhaitable d&#39;injecter des cellules dans les ventricules du cerveau en développement, par exemple si les cellules sont envahissantes suffisant pour accéder au tissu neuronal en l&#39;absence de lésions. L&#39;injection de cellules dans la lumière de tout brAin région exige l&#39;aide d&#39;un stade de développement au cours de laquelle la lumière fournit un récipient assez grand et est facilement accessible; stades HH 12 à 18 sont favorables à cet égard. Une lésion n&#39;est pas nécessaire. Il suffit de percer la paroi du tube neural à la micropipette de verre avant l&#39;injection des cellules. Les éléments clés de la réussite de cette méthode sont la netteté de la micropipette et la soudaineté de la pénétration; trop lent mouvement et la pointe micropipette ne peut fossette la paroi du tube neural sans pénétrer. C. Injection systémique Injections systémiques peuvent être effectuées via les vaisseaux sanguins extra-embryonnaires (à partir de l&#39;étape HH 15, lorsque ces navires sont bien développés). Ce n&#39;est pas rare accompagné de quelques saignements et depuis il ya beaucoup de petites artères et des veines moins grandes, injections intra-artérielles sont généralement plus sûrs quand il s&#39;agit de la survie de l&#39;embryon. D&#39;autre part, des injections intraveineuses de fournir un accès plus rapide des cellules du cœur et donc probablement une distribution plus égale des cellules. Une injection réussie nécessite une micropipette forte avec un diamètre plus petit que le navire cible. Approche du navire long de son axe à un petit angle avec l&#39;horizontale (environ 30 degrés). Poussez la micropipette contre le navire jusqu&#39;à ce que le bateau commence à obstruer. Puis pousser plus loin dans une entreprise, mouvement brusque de pénétrer. Rentrez lentement jusqu&#39;à ce que le sang est considérée comme nulle par capillarité dans la pointe de la micropipette. L&#39;injection de cellules doit alors être effectuée en utilisant une pression constante, après quoi la micropipette est rentré avec un mouvement rapide. 8. Etanchéité de l&#39;oeuf <ol><li> Après l&#39;injection, laissez l&#39;oeuf rester immobile pendant quelques minutes pour permettre aux cellules injectées à s&#39;établir et à se conformer. Pour éviter la déshydratation (qui peut se produire rapidement et peut s&#39;avérer mortelle), poser un morceau de tissu imbibé ou papier filtre sur la fenêtre pendant cette période de repos. </li><li> Après quelques minutes, et les cellules se sont installés, sèche la coquille autour de la fenêtre et sceller la fenêtre avec du ruban de plastique conventionnels. Assurez-vous que ce joint est serré et que personne ne peut fuir l&#39;albumine par l&#39;ouverture ou entre la coquille et le ruban (ce qui prouve souvent mortelle pendant l&#39;incubation subséquente). </li><li> Remplacer les oeufs dans l&#39;incubateur à air pulsé pour le développement ultérieur. L&#39;observation peut être faite à intervalles en enlevant le ruban adhésif sur la fenêtre. </li></ol> 9. La dissection des embryons <ol><li> Une fois que l&#39;embryon a atteint le stade désiré, crack ouvrir l&#39;œuf dans un bol de glace froide sérum physiologique ou de tampon phosphate salin (la bande couvrant la fenêtre devrait être la première coupe de permettre aux deux moitiés de la coquille de se séparer). La solution saline glacée sert à anesthésier l&#39;embryon par l&#39;hypothermie. Le cœur devrait rapidement ralentir et s&#39;arrêter au bout de quelques minutes. </li><li> Séparez les embryons à partir des membranes extra-embryonnaires et le mettre en scène en utilisant la réf. 11. </li><li> Décapiter l&#39;embryon, le transférer à un plat de dissection qui a un sol en caoutchouc de silicone et contient du sérum physiologique oxygénée supplémenté en glucose (137 mM NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, 1 mM de Na-phosphate, 5 mM HEPES, 11 mM de glucose, pH 7,4) et la broche qu&#39;elle côté rapide ventrale en place. Retirer les viscères abdominaux et thoraciques. En utilisant une paire de ciseaux à angle, faire des incisions longitudinales le long de chaque aspect de ventrolatérale de la colonne vertébrale. Particulièrement à des stades plus tard (après 6 jours de développement), l&#39;incision initiale est mieux faite dans la région lombo-sacrée, où l&#39;espace entre les vertèbres et la moelle épinière est la plus forte. Retirez la face ventrale de la colonne vertébrale de révéler la moelle épinière. Assurez-vous que le sérum physiologique reste oxygénée par barbotage à environ 10 minutes d&#39;intervalle avec de l&#39;oxygène médical pur. </li><li> Découpez soigneusement les racines naissantes dorsale et ventrale de chaque côté, transect de la moelle épinière au niveau désiré, et puis le soulever doucement du canal vertébral. La moelle épinière va survivre pendant plusieurs heures dans cet état ​​et peut être soumis à 12 anatomiques et physiologiques 13,14 expériences. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. A) L&#39;approche appropriée pour l&#39;évacuation de l&#39;albumine. Notez la position de l&#39;embryon et le placement de l&#39;aiguille. B) contrastées de l&#39;embryon. Notez le point de pénétration de l&#39;aiguille en dehors du disque embryonnaire. C) Représentation schématique de la procédure à suivre pour une lésion unilatérale du tube neural épinière suivie par une transplantation de cellules.

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L&#39;embryon de poulet est un modèle animal pratique et polyvalent pour des expériences de xénotransplantation. L&#39;absence d&#39;un système immunitaire fonctionnel pendant le développement embryonnaire et foetal permet la survie et le développement de cellules provenant d&#39;une espèce qui tolère la température d&#39;incubation. Embryons de poulet ont été utilisés pour tester le potentiel de régénération de divers types de cellules souches (examiné dans la réf. 15). Cellules souches chez les mammifères peuvent intégrer dans les tissus d&#39;embryons de poulet, y compris le système nerveux central, où ils peuvent donner lieu à des projections axonales des neurones dont la connectivité synaptique et les propriétés électrophysiologiques peuvent être évalués dans le contexte de 1,2 fonctionnelle des circuits neuronaux. Parce que les procédures chirurgicales sont relativement faciles, et les injections sont faites en vertu visuelle au lieu de contrôle stéréotaxique, le nombre d&#39;embryons peuvent facilement être augmentée pour s&#39;adapter à différentes conditions expérimentales au sein d&#39;une seule expérience. Généralement les cellules peuvent être injectées dans des embryons de 20 à 30 au sein d&#39;une expérience de 4 heures. La mortalité post-injection de l&#39;embryon est le principal facteur limitant. Des précautions doivent être prises pour éviter une hémorragie et de déshydratation. Soyez conscient qu&#39;il ya certaines étapes critiques du développement à laquelle le taux de mortalité naturelle augmente. Complétant l&#39;embryon avec quelques ml d&#39;eau tiède, l&#39;injection de poulet sonnerie stérilisé suivant et le jour avant les stades critiques du développement, ainsi que d&#39;assurer que la fenêtre dans l&#39;œuf est bien scellé et orientée pour éviter les fuites, améliore la survie. Si une fuite à travers le joint de bande doit se produire, retirez le ruban adhésif, les surfaces sèches et re-bande. Certains chercheurs utilisent de la cire et le verre ou en plastique des lamelles pour sceller la fenêtre. La mortalité ne devrait pas être substantiellement différentes de injectés par rapport opérés de manière fictive embryons. Bien que nous nous sommes concentrés ici sur l&#39;injection de cellules souches humaines dans l&#39;ébauche du cerveau et la moelle épinière, les cellules souches peuvent également être injecté dans l&#39;ébauche d&#39;autres organes (voir réf exemple. 4). Chaque organe pose ses propres défis. Par exemple, l&#39;injection dans le coeur peut être difficile en raison de la résistance mécanique élevée à la pipette la pénétration et à cause de mouvements, qui d&#39;autre part peut être ralentie par le refroidissement des embryons à la température ambiante avant l&#39;injection. Les organes qui n&#39;ont pas de lumière ne peut pas accueillir l&#39;injection de volumes suffisants et peut donc nécessiter une lésion chirurgicale afin de créer un réceptacle. Dans notre expérience, la régénération des tissus après une lésion est un avantage car elle favorise l&#39;intégration des cellules souches humaines dans le tissu. Les cellules peuvent également être injecté dans le mésenchyme embryonnaire comme le mésenchyme somitique dispersion ou de la crête neurale migrent en tant que moyen de parvenir à l&#39;incorporation dans les produits dérivés mésenchymateux, y compris les dérivés de la crête neurale ganglions périphériques 16,17.

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<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
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<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
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<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
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<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
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xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

L&#39;embryon de poulet est un modèle animal classique pour étudier le développement normal de l&#39;embryon et du fœtus et pour des expériences de xénotransplantation d&#39;étudier le comportement des cellules dans un standardisés<em&gt; In vivo</em&gt; L&#39;environnement. Les principaux avantages de l&#39;embryon de poulet sont à faible coût, grande accessibilité, facilité de manipulation chirurgicale et l&#39;absence d&#39;un système entièrement développé immunitaire. La xénotransplantation dans des embryons de poulet peuvent fournir de précieuses informations sur la prolifération cellulaire, la différenciation et le comportement, les réponses des cellules aux signaux définis niches tissu embryonnaire, et le potentiel tumorigène. La transplantation de cellules dans des embryons de poulet peuvent également être une étape vers des expériences de transplantation dans des modèles animaux d&#39;autres. Récemment, l&#39;embryon de poulet a été utilisé pour évaluer le potentiel neurogénique des souches humaines et des cellules progénitrices après l&#39;implantation dans les neurones anlage<sup&gt; 1-6</sup&gt;. Dans cette vidéo, nous documentons toute la procédure de transplantation de cellules souches humaines dans le système nerveux central en développement de l&#39;embryon de poulet. La procédure débute par une incubation des œufs fécondés jusqu&#39;au embryons de l&#39;âge désiré se sont développées. La coquille est alors ouvert, et l&#39;embryon contrastée par injection de colorant entre l&#39;embryon et le jaune. De petites lésions sont faites dans le tube neural en utilisant la microchirurgie, la création d&#39;un site pour le dépôt de régénération cellulaire qui favorise l&#39;intégration ultérieure dans le tissu hôte. Nous démontrons des injections de cellules souches humaines dans de telles lésions faites dans la partie du tube neural qui forme le rhombencéphale et la moelle épinière, et dans la lumière de la partie du tube neural qui se forme dans le cerveau. Injections dans les veines systémiques extra-embryonnaires et les artères sont également révélées comme un autre moyen de produire des cellules dans les tissus vascularisés, y compris le système nerveux central. Enfin, nous montrons comment faire pour supprimer l&#39;embryon de l&#39;oeuf après plusieurs jours de développement et comment disséquer la moelle épinière gratuit pour ultérieures analyses physiologiques, histologiques et biochimiques.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Dans ce papier nous présentons une méthode de transplantation de cellules souches humaines dans les différentes régions du système nerveux central de l&#39;embryon de poulet. Ceci fournit une<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle pour évaluer la prolifération et la différenciation de divers types de cellules souches humaines dans des environnements tissu embryonnaire.

La xénotransplantation de cellules souches humaines dans l&#39;embryon de poulet

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K vues.  University of Oslo. Dans ce papier nous présentons une méthode de transplantation de cellules souches humaines dans les différentes régions du système nerveux central de l'embryon de poulet. Ceci fournit une In vivo Modèle pour évaluer la prolifération et la différenciation de divers types de cellules souches humaines dans des environnements tissu embryonnaire.

Vidéo: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfection des cellules souches humaines à l&#39;Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Comptage des cellules souches humaines

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Le repiquage des cellules souches humaines

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

En électroporations Ovo d&#39;embryons au stade de poulet 10 HH

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...