DF con el apoyo de una Puentes NSF para la beca de doctorado. El microscopio usado en este trabajo es apoyado en parte por el microscopio de imagen de infraestructura de red central de la concesión de Colorado State University. El trabajo de los adaptadores de clatrina en el laboratorio del autor s con el apoyo de la CSU fondos iniciales y la adjudicación Asociación Americana del Corazón 09SDG2280525 a SD

1. Incorporación de una etiqueta de las buenas prácticas agrarias y marcador de selección en el gen SLA1 Aplicar el método Longtine 17, a fin de fusionar una etiqueta de las buenas prácticas agrarias directamente en el extremo 3 &#39;del marco de lectura abierta del gen SLA1 (Sla1p C-terminal) y al mismo tiempo marca el gen con la E. coli kan r gen que permite la selección G418. <ol><li> Generar un fragmento de ADN por PCR utilizando como molde el plásmido pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 y los siguientes cebadores: adelante, 5&#39;-CA AGG CAA CCG AAC ATA TTC AAT ACT GCA GCT TCA AAT CCG TTT GGA CGG TTC ATC CCC GGG ATT ATT AA-3 &#39;, e invertir, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT TTA AAA AAA ATC TAC TCA AAT GAA TTC GAG CTC TAA GTT AC-3&#39;. La secuencia subrayada corresponde al segmento de gen específico SLA1 inmediatamente anterior (cebador) y después del codón de parada (primer inversa). Aislar el producto de PCR por electroforesis en gel de agarosa seguido por la purificación de ADN. </li><li> Preparar un cultivo de S. 50 ml cerevisiae cepa SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, LYS2-801, SUC2 Δ9-GAL-MEL) 19 de YPD, cada vez mayor en la fase temprana logarítmica (OD 600 = 0,2 hasta 0,6). Girar a temperatura ambiente durante 3 minutos a 2.000 xg, lavar dos veces con agua estéril. </li><li> Transformar el fragmento de PCR obtenido en el paso 1 en las células mediante el procedimiento de acetato de litio 20. Lavan las células con 1 ml de agua estéril, añadir 1 ml de YPD y se incuba durante 4 horas a 30 ° C en un agitador. </li><li> Propagación de las células en placas de YPD-G418 para seleccionar transformantes resistentes a G418, se incuba a 30 ° C durante 2-3 días. Elige las colonias y los racha de YPD-G418 placas. </li><li> Usando la colonia-PCR, identificar transformantes en el que se integró el módulo de GFP-kan correctamente con el SLA1 secuencias de genes por recombinación homóloga. Utilizar un cebador que hibrida en el marco de lectura abierta SLA1 y un cebador inverso que hibrida en el interior del módulo de GFP-kan. Identificar las colonias que los productos de PCR del tamaño esperado y verificar por secuenciación. </li><li> Pantalla de las colonias por microscopía de fluorescencia para confirmar que han fluorescencia de GFP. </li></ol> 2. La mutación de la caja de la variante de clatrina (CCV) en el gen SLA1 <ol><li> Introducir un LLDLQ a una mutación en el gen AAALQ SLA1 (nucleótidos 2.407 hasta 2.415) después de un enfoque en dos fases 15. </li><li> En primer lugar, ampliar SLA1 nucleótidos 1207-1410 y 2427-2589 por PCR y clonar los fragmentos en NotI / BamHI y EcoRI / SalI sitios de pBluescriptKS, respectivamente. </li><li> Subclon en los sitios BamHI / EcoRI un fragmento de PCR que contiene URA3. </li><li> Unirá el plásmido resultante con NotI / SalI, aislar el fragmento URA3 por purificación en gel, e introducirlo por la transformación de litio acetato en la cepa Sla1-GFP generado en la parte 1, o en TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 LYS2-801-SUC2 Δ9 PEP4:: LEU2 PRB1:: HISG PRC1:: HIS3) 21. </li><li> Propagación de las células en las placas SD complementado falta uracilo. Confirmar por la colonia-PCR y secuenciación de que el Ura + colonias contienen URA3 debidamente integrado sustituyendo el fragmento de VCB. </li><li> En un segundo paso, subclon SLA1 nucleótidos 1207-2589 en NotI / SalI sitios de pBluescriptKS. Utilizando el QuickChange-XL mutagénesis dirigida kit (Stratagene), mutar los residuos VCB LLDLQ a AAALQ. Verificar por secuenciación. </li><li> Unirá la construcción resultante con BsgI / AgeI, y aislar el BCV mutante que contiene fragmentos de purificación en gel. Cotransform el fragmento BsgI / AgeI con pRS313 (HIS3) 22 en la cepa obtenida en la Parte 2.3. </li><li> Propagación de las células en las placas SD complementado carecen de histidina. Su placa de réplica-colonias + en un medio de agar que contienen ácido 5-fluorotic para identificar las células en las que las secuencias mutantes reemplazado URA3, regenerando así el gen que contiene la sla1 LLDLQ a la mutación AAALQ (sla1 AAA). Confirmar por la colonia-PCR y secuenciación. </li></ol> 3. Microscopía de fluorescencia <ol><li> Crecen las cepas de levadura Sla1-GFP y sla1 AAA-GFP generado en las partes 1 y 2 en 4 ml de complementarse SD medios de comunicación a 30 ° C en un rotor en la oscuridad hasta llegar a un OD 600 = 0,1-0,4. Giro de 1 ml de la cultura en microcentrífuga a 4.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. Deseche ~ 950 l de sobrenadante. Resuspender las células en el líquido residual (~ 50 l). </li><li> Depósito de 3 l de la suspensión de células en un portaobjetos de microscopio y se cubre con un cubreobjetos. Proteger la muestra de la luz. </li><li> Montaje de diapositivas en un 100x de inmersión en aceite objetivo de un microscopio confocal de girar discos. </li><li> Localizar plano correcto focal de las células utilizando iluminación campo claro o 488 nm láser con los filtros adecuados para excitar y detectar la fluorescencia de GFP. </li><li> Captura de imágenes con lapso de tiempo de Sla1-GFP y sla1 AAA-GFP en las células con el tiempo de exposición de 500 ms (o valor apropiado) a unan intervalo de una imagen por segundo durante 150 segundos. Resultado esperado: punctae GFP etiqueta aparecerá en la superficie interna de la membrana limitante de la célula, persisten durante varios segundos, y moverse hacia el centro de la célula como la señal desaparece rápidamente (lo que indica capa de desmontaje). </li><li> Seleccione una parte de una imagen en la que los puntos se considera que aparecen, permanecen durante varios segundos, y desaparecen. La cosecha de este apartado de la imagen en cada fotograma de las imágenes con lapso de tiempo. </li><li> Generar un quimógrafo representa esta sección de la imagen en cada fotograma de la 150 segundos de lapso de tiempo la imagen mediante la alineación de los marcos a lo largo de un eje correspondiente al tiempo transcurrido. </li><li> Calcular la duración de cada spot basado en el número de segundos (tiempo transcurrido-frames) los puntos se encuentra en el quimógrafo. Tenga en cuenta que cada punto debe &quot;curva&quot; hacia el interior de la célula, ya que está desapareciendo, lo que refleja la endocitosis y el desmontaje de la cubierta. </li><li> Comparar el tipo salvaje Sla1-GFP con sla1 AAA-GFP. Repita el procedimiento para determinar si los resultados son estadísticamente significativos. Resultado esperado: sla1 AAA-GFP manchas persisten mucho más tiempo (~ 80 seg) que las cepas silvestres (~ 30 seg), que indica un defecto en la formación de capa 15. </li></ol> 4. Preparación de extracto de levadura y extracto citosólico total de células <ol><li> Inocular 3 litros de YPD con una cepa de levadura adecuada, como TVY614 21, y crecen a 30 ° C en una incubadora de agitación hasta alcanzar una OD 600 = 2.1. </li><li> Centrifugar el cultivo de levadura a temperatura ambiente durante 20 minutos a 3700 x g. Descartar el sobrenadante, añadir 5.3 ml de agua estéril, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que la pastilla se resuspendió completamente. </li><li> Vierta ~ 150 ml de nitrógeno líquido en un vaso de plástico de 250 ml. Flash congelar la levadura añadiendo gota a gota en el nitrógeno líquido en un patrón circular para evitar la aglutinación de los gránulos congelados. No deje que el deshielo de pellets, añadir más nitrógeno líquido si es necesario. </li><li> Una frialdad de acero inoxidable licuadora mediante el vertido de nitrógeno líquido en ella. Permita que el nitrógeno líquido se evapore casi por completo. Añadir la levadura pellets congelados en el frío vaso de la licuadora. Cierre el vaso de la licuadora con un tapón de goma fría y moler las pastillas de levadura de 10 segundos. Invertir veces el envase 3.4 para mezclar el contenido y repetir la etapa de molienda en dos ocasiones. La levadura de suelo congelado tendrá un aspecto similar al polvo. </li><li> Enfriar un embudo y un tubo cónico de 50 ml con nitrógeno líquido. Usando el embudo frío, la transferencia de la levadura de tierra en el tubo. La levadura de suelo congelado se puede almacenar a -80 ° C o utilizarse de inmediato. </li><li> Para obtener un extracto citosólico para el análisis de la proteína de fusión GST-afinidad (parte 5), el peso de 3 g de suelo congelado TVY614 la levadura en un tubo cónico de 15 ml y resuspender en 3 ml de solución tampón a temperatura ambiente A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT), que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma). </li><li> Cierre e invierta el tubo varias veces hasta que esté completamente descongelado y luego poner en el hielo. </li><li> Ultracentrífuga el extracto a 4 ° C durante 20 minutos a 300.000 x g. Transferir cuidadosamente el sobrenadante (extracto citosólico) a un tubo cónico con una pipeta sin perturbar el precipitado. Mantenga el extracto citosólico en el hielo. </li><li> Añadir 100 ml de un 50% (v / v) glutatión-Sepharosa suspensión en tampón A. Es conveniente cortar el extremo de la punta con el fin de facilitar la pipeta de las cuentas. Gire a 4 ° C durante 15 minutos, spin-down las cuentas por centrifugación a 4 º C durante 2 min a 1.000 xg, y la transferencia (extracto citosólico) sobrenadante a un tubo nuevo. Reserva 50 l de extracto para el control de entrada. </li><li> Para obtener los extractos totales de células para los experimentos de co-inmunoprecipitación (Parte 6), el uso cepa TVY614 (WT SLA1), la cepa sla1 AAA llevar una LLDLQ a la mutación AAALQ generados en la parte 2 en TVY614 de fondo, y una cepa sla1 llevar a una supresión de la SLA1 gen como GPY3130 23. Peso 2 g de la levadura correspondiente toma de tierra congelada en tubos cónicos y se resuspenden en 2 ml de solución tampón a temperatura ambiente A, que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma) y el 2% Triton X-100. </li><li> Cierre e invierta el tubo varias veces hasta que esté completamente descongelado y luego incubar en hielo durante 10 minutos, de forma periódica mezcla por inversión. </li><li> Transferir el material a tubos de microcentrífuga y el giro a 4 ° C durante 15 minutos a 16.000 xg (máxima velocidad en microcentrífuga). Transferir cuidadosamente el sobrenadante (extracto celular total) a un tubo cónico en el hielo con una pipeta sin perturbar el precipitado. </li><li> Añadir 100 ml de una proteína de 50% (v / v) A-Sepharosa suspensión en tampón A. Gire a 4 ° C durante 15 minutos, spin-down las cuentas por centrifugación a 4 º C durante 2 min a 1.000 xg, y la transferencia el sobrenadante (extracto total) a un tubo nuevo. Reserva 50 l de extracto para el control de entrada. </li></ol> 5. GST-proteína de fusión de ensayo de afinidad <ol><li> Amplificación mediante PCR de un fragmento de containing la variante Sla1p clatrina-box (VCB) (residuos 803-807), se copia en pGEX-5X para obtener pGEX-5X-VCB. Verificar por secuenciación. </li><li> Utilizando pGEX-5X-VCB como una plantilla y la QuickChange-XL mutagénesis dirigida kit (Stratagene), mutar el BCV LLDLQ residuos de AAALQ obtener pGEX-5X-vCBmut. Verificar por secuenciación. </li><li> Expresa GST y las proteínas de fusión GST-VCB y GST-vCBmut en E. coli (BL21 DE3), purificar con glutatión-Sepharosa, elución de las cuentas con el glutatión reducido, diálisis contra PBS, y determinar la concentración de proteínas. </li><li> Etiqueta 3 tubos de microcentrífuga: GST, GST-VCB, y GST vCBmut, y añadir 1 ml de PBS, 30 l de un 50% (v / v) glutatión-Sepharosa suspensión en un buffer, y 50 mg de dialized GST, -VCB, o GST-vCBmut proteínas de fusión. </li><li> Gire a la temperatura ambiente durante 30 min para permitir la encuadernación. </li><li> Lavar las perlas de dos veces con PBS y una vez con tampón A. Añadir 1 ml de extracto de levadura citosólica - preparada como se describe en la Parte 4 - a cada tubo. </li><li> Gire los tubos de 1 hora a 4 ° C, giro 10 segundos a 5.000 xg para sedimentar las cuentas, eliminar el sobrenadante y lave rápidamente las cuentas 3 veces con tampón A que contiene 0,1% de tiempo de Triton X-100, y 1 con tampón A. </li><li> De girar las bolas una vez más y con una punta de carga de gel eliminar la mayor cantidad de líquido posible. En este punto, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C para continuar en otro momento. </li><li> Añadir 15 l de tampón de muestra Laemmli 2x a cada tubo, se incuba a 96 ° C durante 5 minutos, y el giro 10 segundos a 5.000 x g. </li><li> Analizar las muestras por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra la cadena pesada de clatrina. Resultados esperados: clatrina se une a GST-VCB, pero no a GST o GST vCBmut. También se analizan las muestras por SDS-PAGE para confirmar la carga similar de las proteínas de fusión GST. </li></ol> 6. Co-inmunoprecipitación ensayo <ol><li> Etiqueta 3 tubos de microcentrífuga: WT (de tipo salvaje SLA1), sla1 AAA, y sla1Δ, y añadir 1 ml de PBS, 30 l de una proteína de 50% (v / v) A-Sepharosa suspensión en un buffer, y 2 mg de un conejo anti-anticuerpos Sla1p. </li><li> Gire a la temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lave las cuentas dos veces con PBS y una vez con tampón A conteniendo 1% de Triton X-100. </li><li> Añadir 1 ml de los extractos de levadura total correspondiente elaborado en la Parte 4: SLA1, sla1 AAA, y sla1Δ. Gire 1 hora a 4 ° C. </li><li> Girar 10 segundos a 5.000 xg para sedimentar las cuentas, eliminar el sobrenadante, y lávese rápidamente las cuentas 3 veces con tampón A que contiene 0,1% de Triton X-100, y una vez con tampón A. </li><li> De girar las bolas una vez más y con una punta de carga de gel eliminar la mayor cantidad de líquido posible. En este punto, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C para continuar en otro momento. </li><li> Añadir 15 l de tampón de muestra Laemmli 2x a cada tubo, se incuba a 96 ° C durante 5 minutos, y el giro 10 segundos a 5.000 x g. </li><li> Analizar las muestras por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra la cadena pesada de clatrina. Resultados esperados: clatrina co-inmunoprecipitados con Sla1p de tipo salvaje, pero no con sla1 AAA, o en la muestra sla1Δ. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Análisis de adaptador Sla1p clatrina en los sitios de endocítica por microscopía de fluorescencia de células en vivo. Un cuadro (izquierda) de un video y kymographs correspondiente (derecha) de las células de levadura que expresan Sla1-GFP o sla1 AAA-GFP llevar una LLDLQ a la mutación AAALQ. Tanto de tipo salvaje y mutante Sla1-GFP se expresa a partir de las variables endógenas SLA1 lugar. Sitios endocítica se observan como puntos brillantes distribuidos en la periferia de la célula (imagen izquierda). El área entre las líneas blancas corresponde a la región de la que kymographs se generaron. Películas fueron tomadas a una velocidad de 1 fotograma / seg. Aviso de la vida útil más larga de Sla1-GFP en el LLDLQ a AAALQ mutante (sla1 AAA), en comparación con el tipo salvaje (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Interacción física entre clatrina y la caja de Sla1p variante de clatrina. GST fusionada al fragmento Sla1p aa798-813 que contiene la secuencia LLDLQ (GST-VCB), el correspondiente mutante AAALQ (GST-vCBmut) o GST sola (GST) estaban destinados a la glutatión-Sepharosa cuentas e incubadas con un extracto citosólico de salvaje el tipo de células de levadura. Las proteínas asociadas se eluyeron y analizadas por inmunoblotting (IB) de la cadena pesada de clatrina.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Clathrin vesículas con cubierta (CCV) participan en la endocitosis y el transporte de la red trans Golgi y los endosomas, las vías de conservación que son fundamentales para la biología de las células eucariotas. Los enfoques descritos en este documento los métodos son útiles para estudiar los mecanismos moleculares responsables de la formación de CCV, en particular, las interacciones entre las proteínas y el adaptador de clatrina. De fusión GST-afinidad de proteínas y ensayos de inmunoprecipitación...

<table border="1"><th> Material </th><th> Empresa </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL mutagénesis dirigida kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> cóctel de inhibidores de la proteasa </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Una importante vía endocítica se inicia con la formación de vesículas de clatrina recubiertos (CCV) que transportan cargas de la superficie celular de endosomas 1-6. CCV se distinguen por una red poliédrica de clatrina que cubre la membrana de la vesícula y sirve como un andamio mecánico. Abrigos de clatrina se ensamblan en la formación de vesículas de clatrina triskelia individuales, la forma soluble de clatrina compuesto por tres subunidades de la cadena pesada y tres de luz 7,8. Debido a que el triskelion no tiene la capacidad de unirse a la membrana directamente, clatrina vinculante adaptadores son fundamentales para vincular la red de clatrina que forman la membrana a través de la asociación con los lípidos y / o proteínas de membrana 9. Adaptadores también transmembrana paquete de proteínas de carga, como los receptores, y pueden interactuar entre sí y con otros componentes de la formación CCV maquinaria 9. Más de veinte adaptadores de clatrina se han descrito, hay varios implicados en la endocitosis mediada por clatrina y otros localizar a la red trans Golgi o endosomas 9. Con la excepción de HIP1R (levadura Sla2p), todos los adaptadores de clatrina conocidos se unen al dominio N-terminal-hélice de la cadena pesada de clatrina 9. Adaptadores de clatrina son proteínas modular que consta de dominios cruzados conectados por conectores flexibles no estructurados. Dentro de estas regiones enlazador, a corto motivos de unión a mediar en la interacción con la clatrina N-terminal de dominio o de otros componentes de la formación de vesículas maquinaria 9. Dos distintas clatrina motivos de unión se han definido: la caja de clatrina y la caja de W-9. El consenso de clatrina-box secuencia se había definido como L [L / I] [D / E / N] [I / F] [D / E] 10, pero las variantes se han descubierto posteriormente 11. El W-box se ajusta a la secuencia de PWxxW (donde x es cualquier residuo). Sla1p (sintética letal con la proteína de unión actina-1) fue originalmente identificado como una proteína actina asociados y es necesaria para la estructura normal del citoesqueleto de actina y la dinámica en los sitios de endocitosis en células de levadura 12. Sla1p también se une a la señal de NPFxD clasificación endocítica y es fundamental para la endocitosis de la carga que lleva la señal de NPFxD 13,14. Más recientemente, se demostró que Sla1p unen clatrina a través de un motivo similar a la caja de clatrina, LLDLQ, denominada variante de clatrina-box (VCB), y para funcionar como un adaptador de endocitosis clatrina 15. Además, Sla1p ha convertido en un marcador ampliamente utilizado para la capa de endocítica en los estudios de microscopía de fluorescencia de células vivas 16. Aquí se utiliza Sla1p como un modelo para describir los enfoques de los estudios de interacción clathrin adaptador. Nos centramos en la microscopía de fluorescencia de células en vivo, GST-pull down, y los métodos de co-inmunoprecipitación.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin endocitosis mediada depende de las proteínas adaptador que coordinar la selección de carga y montaje capa clatrina. A continuación se describen los procedimientos para el estudio del adaptador de clatrina interacción física y imágenes de células vivas enfoques, utilizando como modelo la levadura endocítica Sla1p adaptador de proteínas.

In vivo e in vitro de adaptador de clatrina-Interacción

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K vistas.  Colorado State University. Clathrin endocitosis mediada depende de las proteínas adaptador que coordinar la selección de carga y montaje capa clatrina. A continuación se describen los procedimientos para el estudio del adaptador de clatrina interacción física y imágenes de células vivas enfoques, utilizando como modelo la levadura endocítica Sla1p adaptador de proteínas.

Video: In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Investigación

Biología

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Análisis de calcificación vascular mediada por vesícula extracelular utilizando modelos in vitro e in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...