DF wird von einem NSF Brücken in die Promotion Stipendium gefördert. Das Mikroskop in dieser Arbeit verwendet wird teilweise durch das Mikroskop Imaging Network Kerninfrastruktur Zuschuss von der Colorado State University unterstützt. Die Arbeiten an Clathrin-Adapter in Laboratorium des Autors wird von CSU Start-up-Fonds und der American Heart Association ausgezeichnet 09SDG2280525 auf SD unterstützt

1. Der Einbau eines GFP-Tag und Selektionsmarker in der SLA1 Gen Übernehmen Sie die Longtine Methode 17, um eine GFP-Tag direkt Sicherung am 3 &#39;Ende des Gens SLA1 open reading frame (Sla1p C-Terminus) und gleichzeitig markieren das Gen mit dem E. coli kan r-Gen, das für die G418-Selektion ermöglicht. <ol><li> Generieren Sie ein DNA-Fragment mittels PCR unter Verwendung als Vorlage das Plasmid pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 und den folgenden Primern: vorwärts, 5&#39;-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 &#39;und reverse, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3&#39;. Die unterstrichene Sequenz entspricht der SLA1 Gen spezifischen Segment unmittelbar vor (Vorwärts-Primer) und nach dem Stop-Codon (Reverse-Primer). Isolieren Sie die PCR-Produkt durch Agarosegelelektrophorese von DNA-Aufreinigung gefolgt. </li><li> Bereiten Sie eine 50 ml Kultur S. cerevisiae SEY6210 Stamm (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) 19 in YPD, wächst in den frühen logarithmischen Phase (OD 600 = 0,2 bis 0,6). Spin bei Raumtemperatur für 3 min bei 2.000 xg, zweimal waschen mit sterilem Wasser. </li><li> Transform des PCR-Fragments in Schritt 1 in den Zellen unter Verwendung des Lithium-Acetat Verfahren 20 erhalten. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml sterilem Wasser, 1 ml YPD und Inkubation für 4 h bei 30 ° C in einem Shaker. </li><li> Verbreiten Sie die Zellen auf YPD-G418-Platten für G418-resistente Transformanten, bei 30 ° C für 2-3 Tage inkubiert wählen. Pick-Kolonien und streifenfrei sie auf YPD-G418-Platten. </li><li> Mit Kolonie-PCR, identifizieren Transformanten, in denen die GFP-kan-Modul korrekt mit der SLA1 Gensequenzen durch homologe Rekombination integriert wurde. Verwenden Sie ein Forward-Primer, die glüht im SLA1 open reading frame und ein Reverse-Primer, der glüht im Inneren des GFP-kan-Modul. Identifizieren Kolonien, die PCR-Produkte der erwarteten Größe und überprüfen Sie durch Sequenzierung. </li><li> Bildschirm die Kolonien durch Fluoreszenzmikroskopie zu bestätigen haben sie GFP-Fluoreszenz. </li></ol> 2. Mutation der Variante Clathrin Box (VCB) in der SLA1 Gen <ol><li> Einführung eines LLDLQ zu AAALQ Mutation im Gen SLA1 (Nukleotide 2407-2415) nach einem zweistufigen Ansatz 15. </li><li> Zunächst verstärken SLA1 Nukleotide 1207-1410 und 2427-2589 durch PCR und Klonierung der Fragmente in NotI / BamHI und EcoRI / SalI von pBluescriptKS jeweils. </li><li> Subklon in die BamHI / EcoRI-Sites eine PCR-Fragment, das URA3. </li><li> Cleave das resultierende Plasmid mit NotI / SalI, isolieren die URA3-Fragment von Gelreinigung und führen sie durch Lithium-Acetat-Transformation in die SLA1-GFP-Stamm in Teil 1, oder in TVY614 (MATa ura3-52 leu2-3112 his3-Δ200 trp1 generiert -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 PEP4:: LEU2 PRB1: hisG PRC1:: HIS3) 21. </li><li> Verbreiten Sie die Zellen auf SD ergänzt Platten ohne Uracil. Bestätigen Sie mit der Kolonie-PCR und Sequenzierung, dass die Ura +-Kolonien gut integrierten URA3 enthält anstelle der VCB-Fragment. </li><li> In einem zweiten Schritt Subklon SLA1 Nukleotide 1207-2589 in NotI / SalI von pBluescriptKS. Mit den QuickChange-XL Mutagenese-Kit (Stratagene), mutieren die VCB-Rückstände LLDLQ zu AAALQ. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung. </li><li> Cleave das resultierende Konstrukt mit BSGI / AgeI, und zu isolieren, die Mutante VCB mit Fragment durch Gel-Reinigung. Cotransform die BSGI / AgeI Fragment mit pRS313 (HIS3) 22 in den Stamm in Teil 2.3. </li><li> Verbreiten Sie die Zellen auf SD-Platten ergänzt fehlende Histidin. Replica-Platte Sein + Kolonien auf Agar-Medium mit 5-fluorotic Säure zu Zellen, in denen das mutierte Sequenzen ersetzt URA3, damit die Regeneration des SLA1 Gen, das die LLDLQ zu AAALQ Mutation (SLA1 AAA) zu identifizieren. Bestätigen Sie mit der Kolonie-PCR und Sequenzierung. </li></ol> 3. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Wachsen die Hefestämme SLA1-GFP und SLA1 AAA-GFP in Teil 1 und 2 in 4 ml ergänzt SD-Medien bei 30 ° C in einem Rotator in der Dunkelheit erzeugt bis zum Erreichen einer OD 600 = 0,1 bis 0,4. Spin 1 ml Kultur in Mikrozentrifuge bei 4.000 xg für 1 min bei Raumtemperatur. Discard ~ 950 ul Überstand. Die Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit (~ 50 ul). </li><li> Kaution 3 ul der Zellsuspension auf eine Mikroskopie Objektträger geben und mit einem Deckglas. Schützen Sie die Probe aus Licht. </li><li> Montage auf einer 100x Ölimmersionsobjektiv eines Spinning-Disc konfokalen Mikroskop-Objektträger. </li><li> Suchen richtigen Brennebene Zellen mit Hellfeld oder 488 nm Laser mit geeigneten Filtern zu begeistern und zu erkennen Fluoreszenz von GFP. </li><li> Erfassen Zeitraffer-Bilder von SLA1-GFP und SLA1 AAA-GFP in Zellen mit Belichtungszeit von 500 ms (oder den entsprechenden Wert) bei einern Abstand von einem Bild pro Sekunde für 150 Sekunden. Erwartetes Ergebnis: GFP-markierten Tränenpünktchen wird auf der inneren Oberfläche der Grenzmembran der Zelle angezeigt wird, bestehen für mehrere Sekunden, und bewegen sich zur Mitte der Zelle das Signal schnell verschwindet (Angabe Mantel Demontage). </li><li> Wählen Sie einen Teil eines Bildes, in dem Flecken gesehen zu erscheinen, bleiben für einige Sekunden, und wieder verschwinden. Crop diesem Abschnitt des Bildes für jeden Frame der Zeitraffer-Bilder. </li><li> Generieren Sie ein Kymographion repräsentiert dieser Bereich des Bildes in jedem Frame der 150 Sekunden Zeitraffer-Bild, indem Sie die Bilder entlang einer Achse entspricht der Zeit vergangen ist. </li><li> Berechnen Sie die Dauer der einzelnen Punkt auf, wie viele Sekunden (Time-Lapse-Frames) der Spots ist in der Kymographion basiert. Beachten Sie, dass jeder Ort sollte &quot;Kurve&quot; in Richtung des Inneren der Zelle, wie es verschwindet, was Endozytose und Abbau des Fells. </li><li> Vergleichen Wildtyp SLA1-GFP mit SLA1 AAA-GFP. Wiederholen, um festzustellen, ob die Ergebnisse statistisch signifikant sind. Erwartetes Ergebnis: SLA1 AAA-GFP-Spots bestehen signifikant länger (~ 80 sec) als der Wildtyp (~ 30 sec) einen Defekt in Mantel Bildung 15. </li></ol> 4. Vorbereitung der Hefe zytosolischen Extrakt und insgesamt Zellextrakt <ol><li> Inoculate 3 Liter YPD mit einem geeigneten Hefestamm, wie TVY614 21 und wachsen bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator bis zum Erreichen einer OD 600 = 1-2. </li><li> Centrifuge der Hefekultur bei Raumtemperatur für 20 min bei 3.700 x g. Überstand verwerfen, add 3-5 ml sterilem Wasser und Pipette auf und ab, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. </li><li> Gießen Sie ~ 150 ml flüssigem Stickstoff in einem 250 ml Kunststoffbecher. Flash-Freeze der Hefe durch Zutropfen in den flüssigen Stickstoff in einem kreisförmigen Muster auf Agglutination der gefrorenen Pellets zu vermeiden. Lassen Sie sich nicht die Pellets auftauen, fügen Sie mehr flüssigem Stickstoff, wenn nötig. </li><li> Gefühlt einem Edelstahl-Mixer-Container durch Gießen flüssiger Stickstoff in ihm. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff fast vollständig verdampfen. Fügen Sie die gefrorene Hefe Pellets in die kalte Mixerbehälter. Schließen Sie den Mixer Behälter mit einem kalten Gummistopfen und schleifen die Hefe Pellets für 10 Sekunden. Kehren Sie die Behälter 3-4 mal um den Inhalt zu mischen und wiederholen Sie den Mahlvorgang zweimal. Der Boden gefroren Hefe wird ein Pulver-Aussehen. </li><li> Gefühlt einem Trichter und einem 50 ml konischen Rohr mit flüssigem Stickstoff. Mit der kalten Trichter, übertragen Sie die Masse Hefe mit dem Rohr. Der gefrorene Boden Hefe kann gespeichert werden bei -80 ° C oder sofort verwendet. </li><li> Um eine zytosolische Extrakt für die GST-Fusionsprotein Affinität Test (Teil 5), Gewicht 3 g des gefrorenen Boden TVY614 Hefe in einem 15 ml konischen Rohr und resuspendieren in 3 ml Raumtemperatur Puffer A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma). </li><li> Cap und das Röhrchen mehrere Male, bis sie vollständig aufgetaut und dann auf Eis gelegt. </li><li> Ultrazentrifuge der Extrakt bei 4 ° C für 20 min bei 300.000 x g. Vorsichtig den Überstand (zytosolische Extrakt) zu einem konischen Rohr mit einer Pipette, ohne das Pellet. Halten Sie die zytosolische Extrakt auf Eis. </li><li> Geben Sie 100 ul einer 50% (v / v) Glutathion-Sepharose Suspension in Puffer A. Es ist zweckmäßig, das Ende der Spitze abgeschnitten, um zu erleichtern Pipettieren der Perlen. Drehen bei 4 ° C für 15 min, Spin-down der Beads durch Zentrifugation bei 4 ° C für 2 min bei 1.000 xg und den Überstand (zytosolische Extrakt) in ein frisches Röhrchen. Reserve 50 pl des Extraktes für die Eingabe kontrollieren. </li><li> Um insgesamt Zellextrakten für Co-Immunopräzipitation Experimenten (Teil 6), verwenden Sie belasten TVY614 (WT SLA1), die SLA1 AAA Belastung Bei dem mit LLDLQ zu AAALQ Mutation in Teil 2 in TVY614 Hintergrund erzeugt, und ein SLA1 Stamm, der eine Deletion der SLA1 Gen wie GPY3130 23. Gewicht 2 g der entsprechenden gefrorenen Boden Hefe in konische Rohre und resuspendieren sie in 2 ml Raumtemperatur Puffer A, mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma) und 2% Triton X-100. </li><li> Cap und das Röhrchen mehrere Male, bis sie vollständig aufgetaut und dann auf Eis inkubieren für 10 min, in regelmäßigen Abständen Mischen durch Umdrehen. </li><li> Das Material in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei 4 ° C für 15 min bei 16.000 xg (Höchstgeschwindigkeit in Mikrozentrifuge). Vorsichtig den Überstand (insgesamt Zellextrakt) zu einem konischen Rohr auf Eis mit einer Pipette, ohne das Pellet. </li><li> Geben Sie 100 ul einer 50% (v / v) Protein A-Sepharose Suspension in Puffer A. Drehen bei 4 ° C für 15 min, Spin-down der Beads durch Zentrifugation bei 4 ° C für 2 min bei 1.000 xg und Transfer der Überstand (Gesamtextrakt) in ein frisches Röhrchen. Reserve 50 pl des Extraktes für die Eingabe kontrollieren. </li></ol> 5. GST-Fusionsprotein Affinität Test <ol><li> Amplify von PCR ein Fragment containing der Sla1p Variante Clathrin-box (VCB) (Rückstände von 803 bis 807), Klon es in pGEX-5X, um pGEX-5X-VCB zu erhalten. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung. </li><li> Mit pGEX-5X-VCB als Vorlage und die QuickChange-XL Mutagenese-Kits (Stratagene) site-directed, mutieren die VCB-Rückstände LLDLQ zu AAALQ um pGEX-5X-vCBmut erhalten. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung. </li><li> Express GST und die Fusionsproteine ​​GST-VCB-und GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), reinigen unter Verwendung von Glutathion-Sepharose eluieren von den Perlen mit reduziertem Glutathion, gegen PBS dialysiert und bestimmen Proteinkonzentration. </li><li> Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen: GST, GST-VCB und GST-vCBmut und 1 ml PBS, 30 ul einer 50% (v / v) Glutathion-Sepharose Suspension in Puffer A und 50 ug dialized GST, GST -VCB-oder GST-vCBmut Fusionsproteine. </li><li> Drehen Sie bei Raumtemperatur für 30 min bis zur Bindung ermöglichen. </li><li> Waschen Sie die Perlen 2-mal mit PBS und 1 mal mit Puffer A. 1 ml Hefe zytosolischen Extrakt - wie in Teil 4 beschrieben - in jedes Röhrchen. </li><li> Drehen Sie die Rohre 1 h bei 4 ° C, Spin 10 sec bei 5.000 xg für Pellet die Perlen, Überstand verwerfen und schnell waschen die Perlen 3-mal mit Puffer A mit 0,1% Triton X-100 und 1 Mal mit Puffer A. </li><li> Spin down die Perlen ein weiteres Mal und mit einer Spitze für Gel so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt fortzusetzen. </li><li> Add 15 ul 2x Laemmli-Probenpuffer in jedes Röhrchen, bei 96 ° C für 5 min inkubieren und Spin 10 sec bei 5.000 x g. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen den Clathrin schwere Kette. Erwartete Ergebnisse: Clathrin bindet an GST-VCB aber nicht GST oder GST-vCBmut. Auch die Proben analysieren durch SDS-PAGE, um ähnliche Belastung der GST-Fusionsproteine ​​zu bestätigen. </li></ol> 6. Co-Immunpräzipitationsassay <ol><li> Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen: WT (Wildtyp SLA1), SLA1 AAA und sla1Δ und 1 ml PBS, 30 ul einer 50% (v / v) Protein A-Sepharose Suspension in Puffer A, und 2 ug eines Kaninchen-Anti-Sla1p Antikörper. </li><li> Drehen Sie bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Kugeln zweimal mit PBS und 1 mal mit Puffer A mit 1% Triton X-100. </li><li> 1 ml der entsprechenden insgesamt Hefeextrakte in Teil 4 vorbereitet: SLA1, SLA1 AAA und sla1Δ. Drehen 1 h bei 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec bei 5.000 xg für Pellet die Perlen, Überstand verwerfen und schnell waschen die Perlen 3-mal mit Puffer A mit 0,1% Triton X-100 und 1 Mal mit Puffer A. </li><li> Spin down die Perlen ein weiteres Mal und mit einer Spitze für Gel so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt fortzusetzen. </li><li> Add 15 ul 2x Laemmli-Probenpuffer in jedes Röhrchen, bei 96 ° C für 5 min inkubieren und Spin 10 sec bei 5.000 x g. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen den Clathrin schwere Kette. Erwartete Ergebnisse: Clathrin Zusammenarbeit Immunpräzipitaten mit Wildtyp Sla1p aber nicht mit SLA1 AAA, oder in der sla1Δ Probe. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Analyse von Sla1p Clathrin-Adapter am endocytischen Websites von lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein Frame (links) aus einem Video und entsprechende kymographs (rechts) von Hefe-Zellen, die SLA1-GFP oder SLA1 AAA-GFP Bei dem mit LLDLQ zu AAALQ Mutation. Sowohl Wildtyp und Mutante SLA1-GFP wurden aus dem endogenen SLA1 locus ausgedrückt. Endocytischen Seiten sind als helle Flecken in der Zellperipherie (Bilder links) verteilt beobachtet. Der Bereich zwischen weißen Linien entspricht dem Bereich, aus dem kymographs generiert wurden. Filme wurden bei einer Bildrate von 1 Bild / s aufgenommen. Beachten Sie die längere Lebensdauer der SLA1-GFP in der LLDLQ zu AAALQ Mutante (SLA1 AAA) im Vergleich zum Wildtyp (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Physische Interaktion zwischen Clathrin und der Sla1p-Variante Clathrin Box. GST fusioniert Fragment aa798-813, die die Sequenz LLDLQ (GST-VCB), die entsprechende AAALQ Mutante (GST-vCBmut) oder GST alleine (GST) Sla1p wurden an Glutathion-Sepharose-Beads gebunden und inkubiert mit einem zytosolischen Extrakt aus Wildtyp- Typ Hefezellen. Die zugehörigen Proteine ​​wurden eluiert und durch Immunoblot (IB) für Clathrin schwere Kette analysiert.

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Clathrin-beschichteten Vesikeln (CCV) in Endozytose und Transport vom trans-Golgi-Netzwerk zu beteiligen und Endosomen, konservierte Signalwege, die von grundlegender Bedeutung für eukaryotischen Zelle Biologie. Die Ansätze in diesem Papier beschrieben Methoden sind nützlich, um die molekularen Mechanismen, die für CCV Bildung, insbesondere Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Adapter Clathrin zu studieren. GST-Fusionsprotein Affinität und Co-Immunopräzipitation Assays erlauben Prüfung der physikalisc...

<table border="1"><th> Material </th><th> Firma </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL Mutagenese-Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Ein großer endocytischen initiiert mit der Bildung von Clathrin-coated Vesikel (CCVS), dass der Transport Fracht von der Zelloberfläche bis 1-6 Endosomen. CCVs sind durch eine polyedrische Gitter Clathrin, dass Coats die Vesikelmembran aus und dient als mechanischer Gerüst. Clathrin Mäntel sind während der Vesikelbildung aus einzelnen Clathrin triskelia, die lösliche Form von Clathrin von drei schweren und drei leichten Kette Untereinheiten zusammengesetzt 7,8 montiert. Da die triskelion nicht über die Fähigkeit, sich an die Membran direkt zu binden, sind Clathrin-bindenden Adapter entscheidend für die Bildung von Clathrin Gitter an der Membran Link durch die Verbindung mit Lipiden und / oder Membranproteine ​​9. Adapter auch Paket Transmembranprotein Fracht, wie Rezeptoren und können untereinander und mit anderen Komponenten des CCV-Maschinerie 9 interagieren. Über zwanzig Clathrin-Adapter sind beschrieben worden, mehrere sind in der Clathrin vermittelten Endozytose beteiligt und andere lokalisieren, die trans-Golgi-Netzwerk oder Endosomen 9. Mit Ausnahme der HIP1R (Hefe Sla2p), binden alle bekannten Clathrin-Adapter auf die N-terminal-Propeller-Domäne des Clathrin schwere Kette 9. Clathrin-Adapter sind modular Proteinen bestehend aus gefalteten Domänen von unstrukturierten flexible Linker verbunden. Innerhalb dieser Linker Regionen, vermitteln kurze Bindungsmotive Interaktionen mit dem Clathrin N-terminalen Domäne oder andere Komponenten des Vesikelbildung Maschinen 9. Zwei verschiedene Clathrin-bindenden Motive wurden definiert: die Clathrin-Box und die W-Box-9. Der Konsens Clathrin-Box-Sequenz wurde ursprünglich definiert als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, aber Varianten wurden anschließend 11 entdeckt. Das W-Feld entspricht der Reihenfolge PWxxW (wobei x jede Rückstand). Sla1p (Synthetic Lethal mit Actin bindendes Protein-1) wurde ursprünglich als ein Aktin-assoziierten Protein identifiziert und ist notwendig für den normalen Aktin-Zytoskelett Struktur und Dynamik bei endocytischen Standorten in Hefezellen 12. Sla1p bindet auch die NPFxD endocytischen Sortierung Signal und ist entscheidend für die Endozytose von Fracht mit der NPFxD Signal 13,14. In jüngerer Zeit Sla1p Es wurde gezeigt, binden durch ein Motiv ähnlich wie die Clathrin Box, LLDLQ Clathrin, bezeichnet eine Variante Clathrin-box (VCB), und als endocytischen Clathrin Adapter 15-Funktion. Darüber hinaus hat Sla1p zu einem weit verbreiteten Marker für die endocytischen Mantel in lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie Studien 16. Hier verwenden wir Sla1p als Modell, Ansätze für Adapter-Clathrin Studien zu Wechselwirkungen zu beschreiben. Wir konzentrieren uns auf Live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie, GST-Pull-Down-und Co-Immunopräzipitation Methoden.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.

In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K Aufrufe.  Colorado State University. Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.

Serie: In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Forschung

Biologie

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Doppelfärbungsmethode zum Nachweis von Pektin in der Pflanzen-Pilz-Interaktion

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...