DF est soutenu par une Ponts NSF pour la bourse de doctorat. Le microscope utilisé dans ce travail est soutenu en partie par le microscope Imaging Network subvention d&#39;infrastructure de base du Colorado State University. Les travaux sur les adaptateurs de clathrine dans le laboratoire de l&#39;auteur est soutenue par la CSU fonds de démarrage et de prix de l&#39;American Heart Association 09SDG2280525 à SD

1. L&#39;incorporation d&#39;une balise de la GFP et marqueur de sélection dans le gène SLA1 Appliquer la méthode Longtine 17 afin de fusionner une étiquette GFP directement à l&#39;extrémité 3 &#39;du cadre ouvert de lecture du gène SLA1 (Sla1p C-terminale) et simultanément marquer le gène avec les E. coli Kanr gène qui permet la sélection G418. <ol><li> Générer un fragment d&#39;ADN par PCR en utilisant comme modèle le plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 et les amorces suivantes: avant, 5&#39;-CA AGG CAA CCG AAC ATA TTC AAT GCT LOI GCA ACT AAT GCC TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 &#39;, et renverser, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT GCT TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CCT GTT TAA AC-3&#39;. La séquence soulignée correspond au segment SLA1 gène spécifique qui précède immédiatement (Amorce) et en suivant le codon stop (amorce reverse). Isoler le produit de PCR par électrophorèse sur gel agarose suivie d&#39;une purification d&#39;ADN. </li><li> Préparer une culture de 50 ml S. cerevisiae SEY6210 souche (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, SUC2-Δ9 GAL-MEL) 19 au YPD, de plus en plus à la phase logarithmique précoce (DO600 = 0,2-0,6). Spin à température ambiante pendant 3 min à 2000 xg, laver deux fois avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Transformer le fragment de PCR obtenu à l&#39;étape 1 dans les cellules en utilisant la procédure d&#39;acétate de lithium 20. Laver les cellules avec 1 ml d&#39;eau stérile, ajouter 1 ml YPD et incuber pendant 4 h à 30 ° C dans un shaker. </li><li> Fais les cellules sur YPD-G418 plaques de sélectionner pour le G418 transformants résistants, incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. Prélever des colonies et la strie eux sur YPD-G418 plaques. </li><li> En utilisant la colonie-PCR, d&#39;identifier les transformants dans lequel le module GFP-kan a été bien intégré au SLA1 séquences du gène par recombinaison homologue. Utilisez une amorce sens que recuits dans le cadre de lecture ouvert SLA1 et une amorce inverse qui s&#39;apparie à l&#39;intérieur du module de la GFP-kan. Identifier les colonies qui ont des produits de PCR de la taille attendue et vérifier par séquençage. </li><li> Ecran des colonies par microscopie à fluorescence pour confirmer qu&#39;ils ont fluorescence de la GFP. </li></ol> 2. Mutation de la boîte de variante de la clathrine (VCB) dans le gène SLA1 <ol><li> Introduire un LLDLQ à la mutation dans le gène de AAALQ SLA1 (nucléotides 2407-2415), après une approche en deux étapes 15. </li><li> Tout d&#39;abord, d&#39;amplifier SLA1 nucléotides 1207-1410 et de 2427-2589 par PCR et clone les fragments dans les sites Notl / BamHI et EcoRI / Sall de pBluescriptKS, respectivement. </li><li> Sous-clone dans les sites BamHI / EcoRI contenant un fragment de PCR URA3. </li><li> Enchaînement avec le plasmide résultant Notl / Sall, isoler le fragment URA3 par purification sur gel, et l&#39;introduire par transformation d&#39;acétate de lithium dans la souche SLA1-GFP générées dans la partie 1, ou dans TVY614 (MATa ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 pep4:: LEU2 PRB1:: hisG PRC1:: HIS3) 21. </li><li> Fais les cellules sur des plaques complétées SD dépourvu d&#39;uracile. Confirmez en colonie PCR et séquençage que les colonies Ura + contiennent URA3 correctement intégré remplaçant le fragment VCB. </li><li> Dans une seconde étape, sous-clone SLA1 nucléotides 1207-2589 en Notl / Sall sites de pBluescriptKS. Utilisation de la QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit (Stratagene), muter les résidus VCB LLDLQ d&#39;AAALQ. Vérifiez par séquençage. </li><li> Enchaînement avec la construction résultante BSGI / Agel, et d&#39;isoler le VCB mutant contenant le fragment d&#39;une purification sur gel. Cotransformée le fragment BSGI / Agel avec pRS313 (HIS3) 22 dans la souche obtenue dans la partie 2.3. </li><li> Fais les cellules sur des plaques complétées SD manque histidine. Réplique plaque ses colonies + sur un milieu gélosé contenant l&#39;acide 5-fluorotique pour identifier les cellules où les séquences mutantes remplacé URA3, régénérant ainsi le gène SLA1 contenant les LLDLQ à la mutation AAALQ (SLA1 AAA). Confirmez en colonie PCR et séquençage. </li></ol> 3. La microscopie à fluorescence <ol><li> Cultivez les souches de levure SLA1-GFP et SLA1 AAA-GFP générées dans les parties 1 et 2 dans 4 ml de médias SD complété à 30 ° C dans un agitateur dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à atteindre une DO 600 = 0,1 à 0,4. Spin 1 ml de culture dans microcentrifugation à 4000 xg pendant 1 min à température ambiante. Jeter ~ 950 pi de surnageant. Resuspendre les cellules dans le liquide restant (~ 50 pi). </li><li> Dépôt 3 ul de la suspension cellulaire sur une lame de microscope et couvrir avec une lamelle de verre. Protéger l&#39;échantillon de la lumière. </li><li> Mont glisser sur un 100x immersion dans l&#39;huile l&#39;objectif d&#39;un microscope confocal à filer le disque. </li><li> Localisez correcte plan focal de cellules en utilisant un éclairage fond clair ou 488 nm laser avec des filtres appropriés pour exciter et détecter la fluorescence de la GFP. </li><li> Capturez des images en accéléré du SLA1-GFP et SLA1 AAA-GFP dans les cellules avec des temps d&#39;exposition de 500 ms (ou valeur appropriée) à unintervalle de n d&#39;une image par seconde pendant 150 secondes. Résultat attendu: punctae GFP étiqueté apparaîtra sur la surface intérieure de limiter la membrane de la cellule, persister pendant plusieurs secondes, et se déplacer vers le centre de la cellule comme le signal disparaît rapidement (indiquant manteau de démontage). </li><li> Sélectionnez une partie d&#39;une image dans laquelle des taches on voit apparaître, restent pendant plusieurs secondes, et disparaissent. Recadrer cette section de l&#39;image à chaque trame des images en accéléré. </li><li> Générer un représentant kymographe cette section de l&#39;image dans chaque image de la 150 secondes time-lapse d&#39;image en alignant les cadres le long d&#39;un axe correspondant au temps écoulé. </li><li> Calculer la durée de chaque spot sur la base de combien de secondes (time-lapse cadres), les taches sont présentes dans le kymographe. Notez que chaque spot devrait &quot;courbe&quot; vers l&#39;intérieur de la cellule car elle tend à disparaître, ce qui reflète l&#39;endocytose et le démontage de la robe. </li><li> Comparez type sauvage SLA1-GFP avec SLA1 AAA-GFP. Répétez cette opération pour déterminer si les résultats sont statistiquement significatifs. Résultat attendu: SLA1 AAA-GFP taches persistent significativement plus longue (~ 80 sec) que de type sauvage (~ 30 sec), indiquant un défaut dans la formation de 15 manteau. </li></ol> 4. Préparation d&#39;extrait de levure cytosoliques et extrait cellulaire total <ol><li> Inoculer 3 litres de YPD avec une souche de levure appropriée, comme TVY614 21, et de croître à 30 ° C dans un incubateur agitateur jusqu&#39;à atteindre une DO 600 = 1-2. </li><li> Centrifuger la culture de levure à la température ambiante pendant 20 min à 3700 x g. Jeter le surnageant, ajouter 3-5 ml d&#39;eau stérile, et la pipette de haut en bas jusqu&#39;à ce que le culot est resuspendu complètement. </li><li> Verser ~ 150 ml d&#39;azote liquide dans un bécher de 250 ml en plastique. Flash-geler la levure en ajoutant goutte à goutte dans l&#39;azote liquide dans un modèle circulaire pour éviter l&#39;agglutination des granules congelés. Ne laissez pas le dégel boulettes, ajouter de l&#39;azote liquide au besoin. </li><li> Réfrigérer une en acier inoxydable récipient du mélangeur en versant l&#39;azote liquide en elle. Permettre à l&#39;azote liquide à près de s&#39;évaporer complètement. Ajouter les boulettes levure surgelée dans le récipient froid mélangeur. Fermez le récipient du mélangeur avec un bouchon de caoutchouc à froid et à broyer les pastilles de la levure pendant 10 secondes. Inverser le temps de conteneurs 3-4 à mélanger le contenu et répétez l&#39;étape de broyage à deux reprises. La levure sol gelé aura une apparence comme de la poudre. </li><li> Réfrigérer un entonnoir et d&#39;un tube conique de 50 ml avec de l&#39;azote liquide. Aide de l&#39;entonnoir à froid, le transfert des levures du sol dans le tube. La levure sol gelé peut être conserver à -80 ° C ou utilisé immédiatement. </li><li> Pour obtenir un extrait cytosolique pour le dosage de la protéine de fusion GST-affinité (partie 5), le poids de 3 g de sol gelé TVY614 levure dans un tube de 15 ml conique et remettre en suspension dans 3 ml de tampon A température ambiante (10 mM HEPES, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) contenant un cocktail d&#39;inhibiteur de protéase (Sigma). </li><li> Cap et inverser le tube plusieurs fois jusqu&#39;à ce que complètement décongelés puis mis sur la glace. </li><li> Ultracentrifuger l&#39;extrait à 4 ° C pendant 20 min à 300 000 x g. Soigneusement transférer le surnageant (extrait cytosolique) à un tube conique en utilisant une pipette sans perturber le culot. Gardez l&#39;extrait cytosolique sur la glace. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;un 50% (v / v) de glutathione-Sépharose boue dans le tampon A. Il est commode de couper l&#39;extrémité de la pointe, afin de faciliter pipetage des perles. Tournez à 4 ° C pendant 15 min, spin-down des billes par centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 1000 xg, et le transfert du (extrait cytosolique) surnageant dans un nouveau tube. Réserve 50 ul d&#39;extrait pour le contrôle d&#39;entrée. </li><li> Pour obtenir des extraits cellulaires totaux pour les expériences de co-immunoprécipitation (Partie 6), l&#39;utilisation de contrainte TVY614 (WT SLA1), la souche SLA1 AAA portant un LLDLQ à la mutation AAALQ généré dans la partie 2 de TVY614 fond, et une souche portant une délétion SLA1 de l&#39; SLA1 gènes tels que GPY3130 23. Poids 2 g de levure sol gelé correspondant dans des tubes coniques et les remettre en suspension dans 2 ml de tampon A température ambiante, contenant un cocktail d&#39;inhibiteur de protéase (Sigma) et 2% de Triton X-100. </li><li> Cap et inverser le tube plusieurs fois jusqu&#39;à ce que complètement décongelés puis incuber sur de la glace pendant 10 min, périodiquement mélanger par inversion. </li><li> Transfert de la matière à microtubes et de spin à 4 ° C pendant 15 min à 16000 xg (vitesse de pointe de microcentrifugeuse). Soigneusement transférer le surnageant (extrait cellulaire total) à un tube conique sur la glace à l&#39;aide d&#39;une pipette, sans perturber le culot. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;une protéine de 50% (v / v) A-Sépharose boue dans le tampon A. Tournez à 4 ° C pendant 15 min, spin-down des billes par centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 1000 xg, et le transfert le surnageant (extrait total) dans un nouveau tube. Réserve 50 ul d&#39;extrait pour le contrôle d&#39;entrée. </li></ol> 5. TPS-fusion de dosage de protéines par affinité <ol><li> Amplifier par PCR une containi fragmentng la variante Sla1p clathrine-box (VCB) (résidus 803-807), il clone dans pGEX-5X pour obtenir pGEX-5X-VCB. Vérifiez par séquençage. </li><li> En utilisant pGEX-5X-VCB comme un modèle et le QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit (Stratagene), muter les résidus VCB LLDLQ d&#39;AAALQ pour obtenir pGEX-5X-vCBmut. Vérifiez par séquençage. </li><li> Exprès de la TPS et les protéines de fusion GST-VCB et GST-vCBmut dans E. coli (BL21 DE3), purifier à l&#39;aide de glutathione-Sépharose, éluer des billes avec le glutathion réduit, dialyser contre du PBS, et de déterminer la concentration de protéines. </li><li> Identifier les tubes à centrifuger 3: TPS, TPS-VCB, et GST-vCBmut, et ajouter 1 ml de PBS, 30 pl d&#39;un 50% (v / v) de glutathione-Sépharose boue dans le tampon A, et 50 ug d&#39;dialized TPS, TPS -VCB, ou des protéines de fusion GST-vCBmut. </li><li> Tournez à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à la liaison. </li><li> Laver les billes deux fois avec du PBS et 1 fois avec le tampon A. Ajouter 1 ml d&#39;extrait de levure cytosolique - préparé comme décrit dans la Partie 4 - à chaque tube. </li><li> Tournez les tubes 1 h à 4 ° C, spin 10 sec à 5000 xg pour culotter les perles, éliminer le surnageant et laver rapidement les billes de 3 fois avec le tampon A contenant 0,1% de Triton X-100, et 1 fois avec le tampon A. </li><li> Isoler les perles une fois de plus et en utilisant une pointe de chargement de gel retirer autant de liquide que possible. A ce stade les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pour continuer à une date ultérieure. </li><li> Ajouter 15 ul de tampon d&#39;échantillon de Laemmli 2x à chaque tube, incuber à 96 ° C pendant 5 min, et de spin 10 sec à 5000 x g. </li><li> Analyser les échantillons par immunoblot en utilisant un anticorps dirigé contre la chaîne lourde de clathrine. Résultats attendus: clathrine se lie à la TPS-VCB, mais pas à la TPS ou GST-vCBmut. Également analyser les échantillons par SDS-PAGE pour confirmer le chargement similaire de protéines de fusion de TPS. </li></ol> 6. Co-immunoprécipitation de dosage <ol><li> Identifier les tubes à centrifuger 3: WT (type sauvage SLA1), SLA1 AAA, et sla1Δ, et ajouter 1 ml de PBS, 30 pl d&#39;une protéine de 50% (v / v) A-Sépharose boue dans le tampon A, et 2 pg d&#39;un lapin anti-Sla1p anticorps. </li><li> Tournez à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les billes deux fois avec du PBS et une fois avec le tampon A contenant 1% de Triton X-100. </li><li> Ajouter 1 ml de l&#39;extrait correspondant de la levure total préparé dans la partie 4: SLA1, SLA1 AAA, et sla1Δ. Rotation 1 h à 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec à 5000 xg pour culotter les perles, éliminer le surnageant et laver rapidement les billes de 3 fois avec le tampon A contenant 0,1% de Triton X-100, et 1 fois avec le tampon A. </li><li> Isoler les perles une fois de plus et en utilisant une pointe de chargement de gel retirer autant de liquide que possible. A ce stade les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pour continuer à une date ultérieure. </li><li> Ajouter 15 ul de tampon d&#39;échantillon de Laemmli 2x à chaque tube, incuber à 96 ° C pendant 5 min, et de spin 10 sec à 5000 x g. </li><li> Analyser les échantillons par immunoblot en utilisant un anticorps dirigé contre la chaîne lourde de clathrine. Résultats attendus: clathrine co-immunoprécipite avec Sla1p type sauvage mais pas à des SLA1 AAA, ou dans l&#39;échantillon sla1Δ. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Analyse des Sla1p adaptateur clathrine sur les sites de l&#39;endocytose par microscopie à fluorescence des cellules vivantes. Une trame (à gauche) à partir d&#39;une vidéo et kymographs correspondante (à droite) de cellules de levure exprimant la GFP ou SLA1-SLA1 AAA-GFP transportant une LLDLQ à la mutation AAALQ. Tant de type sauvage et mutant SLA1-GFP ont été exprimés de la endogènes SLA1 locus. Les sites endocytaire sont observées comme des points lumineux répartis dans la périphérie de la cellule (images de gauche). La zone entre les lignes blanches correspond à la région d&#39;où kymographs ont été générés. Films ont été prises à une cadence de 1 image / sec. Notez la durée de vie des SLA1-GFP dans les LLDLQ d&#39;AAALQ mutant (SLA1 AAA) par rapport au type sauvage (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Interaction physique entre la clathrine et la boîte Sla1p variante clathrine. TPS fusionnée à Sla1p fragment aa798-813 contenant la séquence (TPS-VCB) LLDLQ, correspondant AAALQ mutant (TPS-vCBmut), ou GST seule (TPS) étaient liés au glutathion-Sépharose perles et incubés avec un extrait cytosolique du sauvage Type de cellules de levure. Les protéines associées ont été élues et analysées par immunoblot (IB) pour la chaîne lourde de clathrine.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li><li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Clathrine vésicules (CCV) de participer à l&#39;endocytose et le transport à partir du réseau trans de Golgi et les endosomes, les voies qui sont conservés à la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. Les approches décrites dans cet article les méthodes sont utiles pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de la formation CCV, dans les interactions entre les protéines notamment adaptateur et la clathrine. L&#39;affinité des protéines de fusion GST et de co-immunoprécipitation p...

<table border="1"><th> Matériau </th><th> Société </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de protéase </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Une importante voie endocytaire initie avec la formation de vésicules recouvertes de clathrine (CCV) que les cargaisons de transport de la surface de la cellule vers les endosomes 1-6. CCVS sont distingués par un treillis polyédriques de la clathrine qui recouvre la membrane de la vésicule et sert mécaniques échafaud. Manteaux de clathrine sont assemblés lors de la formation des vésicules de clathrine triskelia individuelles, la forme soluble de la clathrine composée de trois lourdes et trois sous-unités de la chaîne légère 7,8. Parce que le triskelion n&#39;a pas la capacité de se lier à la membrane directement, la clathrine contraignante adaptateurs sont indispensables pour relier le réseau formant la clathrine à la membrane par l&#39;association avec les lipides et / ou protéines de la membrane 9. Adaptateurs également des marchandises protéines transmembranaires emballage, tels que des récepteurs, et peuvent interagir les uns avec les autres et avec les autres composantes de la formation CCV machines 9. Plus de vingt adaptateurs de clathrine ont été décrites, plusieurs sont impliqués dans l&#39;endocytose médiée clathrine et d&#39;autres localiser dans le réseau trans de Golgi ou les endosomes 9. À l&#39;exception de HIP1R (levure Sla2p), toutes les cartes connues clathrine se lier au domaine N-terminal-hélice de la chaîne lourde clathrine 9. Adaptateurs de clathrine sont des protéines modulaires constitués de domaines reliés par replié non structurées lieurs. Dans ces régions linker, courts motifs de liaison avec la médiation des interactions clathrine domaine N-terminal ou d&#39;autres composantes de la formation des vésicules machines 9. Deux distinctes clathrine motifs de liaison ont été définis: la boîte clathrine et le W-box 9. Le consensus de clathrine boîte de séquence a été initialement défini comme L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, mais des variantes ont été découvert par la suite 11. Le W-box est conforme à la séquence PWxxW (où x est un résidu). Sla1p (synthétique létale avec l&#39;actine binding protein-1) a été initialement identifié comme une protéine actine associé et est nécessaire pour la structure normale cytosquelette d&#39;actine et la dynamique des sites endocytose dans les cellules de levure 12. Sla1p lie également le signal de tri NPFxD endocytose et est essentielle pour l&#39;endocytose des marchandises portant le signal de NPFxD 13,14. Plus récemment, Sla1p a été démontré pour lier la clathrine par un motif similaire à la boîte de clathrine, LLDLQ, appelée variante de la clathrine boîte (VCB), et de fonctionner comme un adaptateur endocytose clathrine 15. En outre, Sla1p est devenu un marqueur couramment utilisé pour la couche endocytose dans les études de cellules vivantes de microscopie par fluorescence 16. Ici, nous utilisons Sla1p comme un modèle pour décrire les approches pour les études d&#39;interaction adaptateur clathrine. Nous nous concentrons sur la microscopie à fluorescence des cellules vivantes, GST-pull down, et co-immunoprécipitation méthodes.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrine endocytose dépend de protéines adaptatrices qui coordonnent la sélection de fret et de l&#39;assemblage manteau de clathrine. Nous décrivons ici les procédures pour étudier l&#39;adaptateur clathrine interaction physique et imagerie des cellules vivantes approches utilisant comme modèle la levure Sla1p endocytose protéine adaptatrice.

In vivo et in vitro de l&#39;adaptateur-clathrine Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K vues.  Colorado State University. Clathrine endocytose dépend de protéines adaptatrices qui coordonnent la sélection de fret et de l'assemblage manteau de clathrine. Nous décrivons ici les procédures pour étudier l'adaptateur clathrine interaction physique et imagerie des cellules vivantes approches utilisant comme modèle la levure Sla1p endocytose protéine adaptatrice.

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

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Biologie

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Stimulation de la cytoplasmiques ADN de détection Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques par décellularisation

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques basée sur la décellularisation  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.