DF는 박사 교제에 NSF 교량에 의해 지원됩니다. 이 작품에 사용되는 현미경은 콜로라도 주립 대학에서 현미경 이미징 네트워크 코어 인프라 부여에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자의 실험실에서 clathrin 어댑터에 대한 작업은 CSU 시작 자금과 SD로 미국 심장 협회 상을 09SDG2280525 지원합니다

1. SLA1 유전자에 GFP 태그와 선택 마커의 설립 SLA1 유전자 오픈 읽기 프레임의 3 &#39;끝 (Sla1p는 C - 말단)에 직접 GFP 태그를 융합하고 동시에 E.있는 유전자를 표시하기 위해 Longtine 방법 17 적용 G418의 선택을 허용 대장균 관 R 유전자. <ol><li> 템플릿으로 플라스미드 pFA6a - GFP (S65T) kanMX6 18 다음 primers를 사용하여 PCR하여 DNA의 조각을 생성 : 앞으로, 5&#39; - CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG ATT TTA AA - 3 &#39;및 역방향, 5&#39; - CA 두드리는 AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC 문신 AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC CTC GTT TAA 개그 AC - 3. 밑줄 순서 SLA1 유전자 특정 세그먼트 바로 앞 (전방 프라이머)와 정지 코돈 (역방향 프라이머) 다음에 해당합니다. DNA 정화 뒤에 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리. </li><li> 50 ML 문화 S. 준비 cerevisiae SEY6210 변형 (MAΤα ura3 - 52, leu2 - 3, 112 his3 - Δ200, trp1 - Δ901, lys2 - 801, suc2 - Δ9 GAL - 멜) YPD에서 19, 초기 단계 로그 (OD 600 = 0.2-0.6)에서 성장. 2000 XG 3 분 상온에서 스핀, 살균 물로 두 번 씻어. </li><li> 리튬 아세테이트 절차 20을 사용하여 세포에 1 단계에서 얻은 PCR 조각을 변환. 1 ML YPD 30 4 H에 대한 품어 ° 통에 C를 추가, 1 ML 멸균 물을 세포를 씻으십시오. </li><li> 2-3 일동안은 30 ° C에서 품어 G418 방지 transformants에 대한 선택 YPD - G418 플레이트에있는 세포를 확산. YPD - G418 플레이트에 식민지과 탄력을 선택하십시오. </li><li> 를 사용하여 식민지를 PCR, GFP 관 모듈이 제대로 상동 재조합에 의해 SLA1 유전자 시퀀스와 통합어진 transformants를 확인합니다. 앞으로 프라이머를 사용하는 것이 SLA1 오픈 읽기 프레임과 반대되는 입문서 이내 anneals GFP 관 모듈 내부 anneals. PCR 제품 예상 크기를 가지고 시퀀싱에 의해 확인 식민지를 식별합니다. </li><li> 그들은 GFP의 형광을 확인하기 위해 형광 현미경에 의해 식민지를 화면. </li></ol> 2. SLA1 유전자의 변종 clathrin 상자 (VCB)의 돌연변이 <ol><li> 두 단계 접근 15 다음 SLA1 유전자 (세포핵 2407년부터 2415년까지)에 AAALQ 변이에 LLDLQ을 소개합니다. </li><li> 첫째, SLA1 세포핵 PCR에 의해 1207년에서 1410년까지 및 2427년에서 2589년까지를 증폭하고 각각 pBluescriptKS의 노티 / BamHI 및 EcoRI / 살리 사이트에 조각을 복제. </li><li> BamHI / EcoRI 사이트 URA3를 포함하는 PCR의 조각에 Subclone. </li><li> 클리브 노티 / 살리와 결과 플라스미드는 젤 정화하여 URA3 조각을 분리하고, 제 1 부, 또는 TVY614 (마타 ura3 - 52 leu2 - 3112 his3 - Δ200 trp1으로 생성된 Sla1 - GFP 스트레인에 리튬 아세테이트 변환하여 소개 - Δ901 lys2 - 801 suc2 - Δ9 pep4 : LEU2 prb1 : HISG prc1 : HIS3) 21. </li><li> 유라실이 부족해 보충 SD 접시에있는 세포를 확산. 식민지 - PCR에 의해 확인하고 우라 + 식민지 VCB 조각을 교체 제대로 통합 URA3을 포함 순서. </li><li> 두 번째 단계에서, subclone SLA1 세포핵 pBluescriptKS의 노티 / 살리 사이트에 1207년부터 2589년까지. 사용 QuickChange - XL 사이트 이동 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)을 AAALQ에 VCB 잔류물에게 LLDLQ을 변화시키다. 순서로 확인합니다. </li><li> 클리브 결과 BsgI / 아게로 구축하고, 젤 정화에 의해 조각을 포함하고있는 돌연변이 VCB을 분리. 부품 2.3에서 얻어진 변형에 pRS313 (HIS3) 22 BsgI / 아게 조각을 Cotransform. </li><li> 히스티딘이 부족해 보충 SD 접시에있는 세포를 확산. 돌연변이 시퀀스 재생에게 있으므로, AAALQ 변이 (sla1 AAA)에 LLDLQ 들어있는 sla1 유전자를 URA3을 대체하는 세포를 식별 5 fluorotic 산성을 포함하는 한천 배지에 복제 판 그의 + 식민지. 식민지 - PCR 및 시퀀싱에 의해 확인합니다. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> OD 600 = 0.1-0.4에 도달 때까지 효모 변종 30에서 보충 SD 미디어 4 ML에 부품 1과 2 · 어둠의 회전에 C에서 생성된 Sla1 - GFP 및 sla1 AAA - GFP를 성장. 상온에서 1 분 4,000 XG에 microcentrifuge의 문화 1ml를 스핀. 뜨는의 ~ 950 μl를 폐기하십시오. 남은 액체 (~ 50 μl)에 세포를 Resuspend. </li><li> 보증금 3 현미경 슬라이드에 세포 현탁액의 μl와 유리 coverslip로 커버. 빛의에서 샘플을 보호합니다. </li><li> 마운트 회전하는 디스크 공촛점 - 현미경의 100x 기름 침지 목표에 슬라이드. </li><li> GFP의 형광을 자극하고 감지하기 위해 적절한 필터 브라이트 조명 또는 488 nm의 레이저를 사용하여 세포의 정확한 초점 비행기를 찾습니다. </li><li> 500 MS의 노출 시간 (또는 적절한 값)와 세포 Sla1 - GFP 및 sla1 AAA - GFP의 시간 경과 이미지를 캡처1백50초에 대한 초당 하나의 이미지의 N 간격. 예상 결과 : 신호가 빨리 사라로 GFP 표시 punctae은 세포의 세포막을 제한하는 내부 표면에 나타나는 몇 초 동안 유지하고, 세포의 중앙쪽으로 이동합니다 (해체 코트를 나타내는). </li><li> 반점이 나타 몇 초 동안 유지하고, 사라질 볼 수있는 이미지의 부분을 선택합니다. 시간 경과 영상의 각 프레임에 이미지의이 섹션을 자르기. </li><li> 경과 시간에 해당하는 축을 따라 프레임을 정렬하여 150초 시간 경과 이미지의 각 프레임에있는 이미지의이 섹션을 나타내는 kymograph를 생성합니다. </li><li> (시간 경과 프레임) 명소 kymograph에 존재하는 몇 초에 따라 각 지점의 기간을 계산합니다. 각각의 장소 그것이 코트의 endocytosis와 해체를 반영, 사라와 같이 세포의 내부 향해 &quot;곡선&quot;해야합니다. </li><li> sla1 AAA - GFP와 야생 타입 Sla1 - GFP를 비교합니다. 결과는 통계적으로 의미가 있는지 확인하기 위해 반복합니다. 예상 결과 : sla1 AAA - GFP 명소가 코트 형성 15 결함을 나타내는 야생 유형 (~ 30 초) 이상 (~ 80 초) 이상 크게 유지됩니다. </li></ol> 4. 효모 추출물 cytosolic와 전체 세포 추출물의 준비 <ol><li> 같은 TVY614 21로 적절한 효모 변형과 YPD 3 리터를 예방하고, 30 성장 OD 600 = 1-2 도달 때까지 쉐이크 인큐베이터에서 ° C. </li><li> 3,700 X g에서 20 분 상온에서 효모 문화를 원심 분리기. 뜨는을 취소, 멸균 물 3-5 ML을 추가하고 펠렛 완전히 resuspended 때까지 최대 피펫 아래로. </li><li> 250 ML의 플라스틱 비이커에 액체 질소 ~ 150 ML 하거라. 플래시 동결 냉동 알약의 응집을 방지하기 위해 원형 모양의 액체 질소로 dropwise을 추가하여 효모합니다. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 알약의 해동을하게하지 마십시오. </li><li> 거기에 액체 질소를 따르고하여 스테인레스 믹서 컨테이너를 풀어. 액체 질소는 거의 완전히 증발 수 있습니다. 추위 믹서 컨테이너에 냉동 효모 알약을 추가합니다. 감기에 고무 마개와 함께 믹서 컨테이너를 닫고 10 초 동안 효모 알약을 갈아서. 내용을 섞어 두 번 연삭 단계를 반복 컨테이너 3-4 회 반전. 지면 냉동 누룩은 가루 같은 모양을 가지고 있습니다. </li><li> 액체 질소와 퍼널 및 50 ML 원뿔 튜브를 풀어. 추위 깔때기를 사용하여 튜브에 지상 효모를 전송할 수 있습니다. 언 땅에 효모는 -80 ° C 또는 즉시 사용에 저장할 수 있습니다. </li><li> GST - 융합 단백질 선호도 분석 (5 부), 중량 냉동 지상의 3g 15 ML 원뿔 튜브 TVY614 효모와 실온 버퍼 3 ML에 resuspend위한 cytosolic 추출물을 얻으려면 (10 MM의 HEPES, 산도 7.0, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM DTT)는 테아제 억제제 칵테일 (시그마)를 포함. </li><li> 뚜껑과 관에게 완전히 해동 후 얼음에 넣어 때까지 여러 번 반전. </li><li> 4 추출물을 초원 심 분리기 ° 300000 20 분 C X G. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 원뿔 관에 뜨는 (cytosolic 추출)을 전송합니다. 얼음 cytosolic 추출물 보관하십시오. </li><li> 그것은 구슬을 pipeting 촉진하기 위해 끝의 끝을 잘라 편리 버퍼 A에서 50 % (V / V) 글루타티온 - 세파 로스 슬러리 100 μl를 추가합니다. 4 회전 ° C는 15 분, 4 원심 분리하여 비즈 스핀 다운 ° 2 천 XG에 분, 그리고 새로운 튜브에 뜨는 (cytosolic 추출)을 전송을위한 C. 입력 컨트롤에 대한 추출물의 지역 50 μl. </li><li> 공동 immunoprecipitation 실험에 대한 전체 세포 추출물을 (6 부) 얻으려면, 스트레인 TVY614 (WT SLA1) TVY614 배경으로 제 2 부에서 생성된 AAALQ 변이에 LLDLQ를 들고 sla1 AAA 변형, 그리고의 삭제를 들고 sla1 변형을 사용하여 GPY3130 23 같은 SLA1 유전자. 무게 두 원뿔 튜브에 해당 언 땅에 효모의 g와 실온 버퍼 2 ML에서 그들을 resuspend, 테아제 억제제 칵테일 (시그마)와 2% 트리톤 X - 100을 포함하는. </li><li> 캡 완전히 해동 후 주기적으로 역전에 의해 혼합 10 분 얼음 부화까지 튜브를 여러 번 반전. </li><li> 4 microcentrifuge 튜브와 스핀에 자료를 전송 ° C 16,000 XG (microcentrifuge에서 최고 속도)에서 15 분. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 얼음에 원뿔 관에 뜨는 (총 세포 추출물)를 전송합니다. </li><li> 4 회전 버퍼 A에서 50 % (V / V) 단백질 A - 세파 로스 슬러리 100 μl를 추가 ° 스핀 다운 15 분에 대한 C, 4 원심 분리하여 비즈 ° 1000 XG 2 분 C 및 전송 뜨는 (총 추출) 신선한 튜브 수 있습니다. 입력 컨트롤에 대한 추출물의 지역 50 μl. </li></ol> 5. GST - 융합 단백질 선호도 분석 <ol><li> PCR 조각 containi로 확대NG Sla1p 변종 clathrin - 박스 (VCB) (잔류물 803-807)는 pGEX - 5 배 - VCB를 얻을 pGEX - 5 배로 복제. 순서로 확인합니다. </li><li> 템플릿으로 pGEX - 5 배 - VCB를 사용하고 QuickChange - XL의 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)를 사이트 - 감독, pGEX - 5 배 - vCBmut를 얻을 AAALQ하는 VCB 잔류물 LLDLQ을 변화시키다. 순서로 확인합니다. </li><li> 익스프레스 GST 융합 단백질과 GST - VCB와 E.의 GST - vCBmut 대장균 (BL21 DE3)가 감소 글루타티온와 비즈에서 글루타티온 - 세파 로스, elute를 사용하여 정화, PBS에 대한 dialyze 및 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> 라벨 3 microcentrifuge 튜브 : GST, GST - VCB 및 GST - vCBmut하고, PBS 1 ML, 버퍼에 50 % (V / V) 글루타티온 - 세파 로스 슬러리의 30 μl dialized GST, GST의 A, 50 μg을 추가 - VCB 또는 GST - vCBmut의 융합 단백질. </li><li> 바인딩 수 있도록 30 분 상온에서 회전. </li><li> 4 부에 설명된대로 준비 - - 각 튜브에 효모 추출물 cytosolic 1 ML 추가 버퍼 A.있는 비즈에게 PBS로 2 회, 1 시간을 씻으십시오. </li><li> , 5,000 펠렛 비즈에 XG에서 튜브에게 4 1 H ° C, 스핀 10 초 회전 뜨는 폐기하고, 신속하게 버퍼 A.와 버퍼와 비즈에게이 포함된 0.1 % 트리톤 X - 100, 1 시간을 3 회 씻어 </li><li> 한 시간과 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 액체로 제거 비즈를 스핀 다운. 이 시점에서 샘플은 나중에 계속 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> ° C 5 분 96에 품어 각 튜브에 2X Laemmli 샘플 버퍼 15 μl를 추가하고, X G. 5000 10 초 스핀 </li><li> clathrin 중쇄하는 항체를 사용하여 immunoblotting하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 예상 결과 : clathrin는하지만 GST 또는 GST - vCBmut에 GST - VCB에 바인딩합니다. 또한 샘플은 GST 융합 단백질의 유사한 로딩을 확인하기 SDS - PAGE로 분석합니다. </li></ol> 6. 공동 immunoprecipitation 분석 <ol><li> 라벨 3 microcentrifuge 튜브 : WT (야생 유형 SLA1), sla1 AAA, 그리고 sla1Δ, 그리고 PBS 1 ML, 버퍼에 A - 세파 로스 슬러리 50 % (V / V)는 단백질 30 μl의 A, 2 μg을 추가 토끼 반대 Sla1p 항체. </li><li> 30 분 상온에서 회전. </li><li> 버퍼 포함 1퍼센트 트리톤 X - 100 PBS 1 시간 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> SLA1, sla1 AAA 및 sla1Δ : 제 4 준비한 해당 총 효모 추출물 1 ML을 추가합니다. 4 1 H ° C. 회전 </li><li> 스핀 10 초 5,000에서 펠릿 비즈에 XG 뜨는 폐기하고, 신속하게 버퍼와 비즈에게 3 번 씻어 포함 0.1 % 트리톤 X - 100과 버퍼 A. 1 시간 </li><li> 한 시간과 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 액체로 제거 비즈를 스핀 다운. 이 시점에서 샘플은 나중에 계속 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> ° C 5 분 96에 품어 각 튜브에 2X Laemmli 샘플 버퍼 15 μl를 추가하고, X G. 5000 10 초 스핀 </li><li> clathrin 중쇄하는 항체를 사용하여 immunoblotting하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 예상 결과 : clathrin sla1 AAA 또는 sla1Δ 샘플에서와 싶었지만 야생 유형 Sla1p와 함께 공동 - immunoprecipitates. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 라이브 세포 형광 현미경에 의해 endocytic 사이트에서 Sla1p clathrin 어댑터의 분석. Sla1 - GFP 또는 AAALQ 변이에 LLDLQ를 들고 sla1 AAA - GFP를 표현하는 효모 세포의 비디오와 해당 kymographs (오른쪽)에서 하나의 프레임 (왼쪽). 야생 유형과 Sla1 - GFP 돌연변이 모두 내생 SLA1 로커스에서 표현되었다. Endocytic 사이트는 세포 주변 (왼쪽 이미지) 배포 밝은 반점으로 관찰됩니다. 화이트 라인 사이의 지역 kymographs가 생성된하는 지역에 해당합니다. 영화는 1 프레임 / 초의 프레임 속도로 촬영했다. 야생 유형 (SLA1)에 비해 AAALQ 돌연변이 (sla1 AAA)에 LLDLQ에 Sla1 - GFP의 긴 수명을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. clathrin 및 Sla1p - 변형 clathrin 상자 사이의 물리적 상호 작용. GST는 글루타티온 - 세파 로스 구슬로 묶인에서 야생 cytosolic 추출물과 함께 incubated 있던 순서 LLDLQ (GST - VCB), 해당 AAALQ 돌연변이 (GST - vCBmut) 또는 GST 혼자 (GST)를 포함하는 조각 aa798 - 813을 Sla1p하는 융합 유형 효모 세포. 관련 단백질은 clathrin 중쇄에 대한 (IB) immunoblotting에 의해 eluted하고 분석했다.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li><li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Clathrin - 코팅 vesicles (CCV)는 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에서 endocytosis 및 수송에 참여하고, 진핵 세포 생물에 근본 아르 보존 경로를 endosomes. 이 방법은 종이에 설명된 접근 어댑터 단백질과 clathrin 사이에 특히 상호 작용에 CCV 형성에 책임이있는 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다. GST - 융합 단백질의 선호도와 공동 immunoprecipitation의 assays는 어댑터 (후보)와 clathrin 사이의 물리적인 연?...

<table border="1"><th> 자료 </th><th> 회사 </th><tbody><tr><td> QuickChange - XL 사이트 이동 돌연변이 유발 키트 </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 시그마 </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

주요 endocytic 통로가 세포 표면부터 수송화물 1-6 endosomes 것을 clathrin - 코팅 vesicles (CCVs)의 형성과 함께 시작합니다. CCVs는 clathrin되는 외투 소포 막의 polyhedral 격자에 의해 구별하고 기계 발판 역할을하고 있습니다. Clathrin 코팅은 개별 clathrin triskelia 세 무거운 세 가벼운 체인 7,8 subunits로 구성된 clathrin의 수용성 형태의 소포 형성하는 동안 조립하고 있습니다. triskelion 직접 멤브레인에 바인딩하는 기능이 없기 때문에, clathrin 바인딩 어댑터 lipids 및 / 또는 멤브레인 단백질 9 협회를 통해 막으로 형성 clathrin 격자를 연결하기 위해 중요하다. Adaptors 또한 패키지 transmembrane 단백질과 같은 수용체와 같은화물, 그리고 서로와 CCV 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용할 수 있습니다. 스물 이상 clathrin 어댑터는 설명했습니다 몇 가지는 clathrin 매개 endocytosis에 관여하고 다른 사람들은 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에 집중하거나 9 endosomes. HIP1R (효모 Sla2p)를 제외하고, 모든 알려진 clathrin 어댑터 clathrin 중쇄 9 N - 터미널 - 프로펠러 도메인에 바인딩합니다. Clathrin 어댑터는 구조화되지 않은 유연한 linkers로 연결되어 접힌 도메인으로 구성된 모듈형 단백질입니다. 이 링커 지역 내에서 짧은 바인딩 모티프는 clathrin N - 말단 도메인이나 소포 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용을 중재. 별개의 두 clathrin 결합 모티프가 정의되었다 : clathrin - 상자와 W - 박스 9. 합의 clathrin 박스 순서는 원래로 정의했습니다 L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 그러나 변종이 이후 11 발견되었습니다. W - 박스 시퀀스 PWxxW (여기서 x는 모든 찌꺼기가 어디)에 부합. Sla1p는 (굴지 바인딩 단백질 1 합성 치명적인) 원래 굴지 관련 단백질로 식별 및 효모 세포 12 endocytic 사이트에서 정상적인 굴지의 cytoskeleton의 구조와 역학에 대한 필요했습니다. Sla1p 또한 NPFxD endocytic 정렬 신호를 바인딩하고 NPFxD 신호 13,14 베어링화물의 endocytosis를 위해 중요합니다. 최근 Sla1p는 clathrin 상자 LLDLQ과 비슷한 모티프를 통해 clathrin 바인딩하는 시연 되었음 변종 clathrin - 박스 (VCB)라고합니다, 그리고 endocytic clathrin 어댑터 15 기능. 또한, Sla1p 라이브 세포 형광 현미경 연구 16 endocytic 코트에 널리 사용되는 마커되고 있습니다. 여기 어댑터 clathrin 상호 작용 연구를위한 방법을 설명하는 모델로 Sla1p를 사용합니다. 우리가 사는 세포 형광 현미경에 초점을 아래로 GST - 끌어와 공동 immunoprecipitation 방법.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin - 중재 endocytosis는 화물선 선택과 clathrin 코트 어셈블리를 조정 어댑터 단백질에 따라 달라집니다. 우리가 모델로 효모 endocytic 어댑터 단백질 Sla1p를 사용하여 어댑터 clathrin 물리적 상호 작용과 라이브 셀 이미징 방법을 연구하는 절차를 설명합니다.

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K 조회수.  Colorado State University. Clathrin - 중재 endocytosis는 화물선 선택과 clathrin 코트 어셈블리를 조정 어댑터 단백질에 따라 달라집니다. 우리가 모델로 효모 endocytic 어댑터 단백질 Sla1p를 사용하여 어댑터 clathrin 물리적 상호 작용과 라이브 셀 이미징 방법을 연구하는 절차를 설명합니다.

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

연구

생물학

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

세포질 DNA 검출 진학의 자극<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

식물 - 곰팡이 상호 작용에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...