DF é apoiado por uma Bridges NSF à comunhão Doutorado. O microscópio utilizado neste trabalho é apoiado em parte pela Microscope Imaging Network infra-estrutura básica bolsa da Colorado State University. Trabalho em adaptadores de clatrina no laboratório do autor é apoiado pela CSU start-up de fundos e de atribuição da American Heart Association 09SDG2280525 para SD

1. Incorporação de uma tag GFP e marcador selecionável no gene SLA1 Aplicar o método Longtine 17, a fim de fundir um tag GFP diretamente na extremidade 3 &#39;do gene SLA1 quadro de leitura aberto (Sla1p C-terminal) e, simultaneamente, marcar o gene com a E. coli kan gene r que permite a seleção G418. <ol><li> Gerar um fragmento de DNA por PCR usando como modelo o plasmídeo pFA6a-GFP (S65T) kanMX6-18 e os seguintes primers: para a frente, 5&#39;-CA AGG AAC AAC GCC ATA AAT GCT TTC ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG ATT ATT AA-3 &#39;, e reverter, 5&#39;-AGC TTG CA TAT TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA GAG CTC TTC GTT TAA AC-3&#39;. A seqüência sublinhada corresponde ao segmento de gene específico SLA1 imediatamente anterior (forward primer) e seguindo o códon de parada (primer reverso). Isolar o produto de PCR por eletroforese em gel de agarose, seguida de purificação do DNA. </li><li> Prepare a 50 ml cultura S. cerevisiae cepa SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) 19 em YPD, crescendo a fase logarítmica precoce (OD 600 = 0,2-0,6). Giram em temperatura ambiente por 3 min a 2.000 xg, lave duas vezes com água estéril. </li><li> Transformar o fragmento de PCR obtido na etapa 1 para dentro das células usando o procedimento de acetato de lítio 20. Lavar as células com 1 ml de água estéril, adicionar 1 ml YPD e incubar por 4 h, a 30 ° C em um agitador. </li><li> Espalhe a células em YPD-G418 placas selecionar para G418-resistente transformantes, incubar a 30 ° C por 2-3 dias. Escolha colônias e raia-los em YPD-G418 placas. </li><li> Utilizando-colônia PCR, identificar transformantes em que o módulo GFP-kan foi devidamente integrado com o SLA1 seqüências de genes por recombinação homóloga. Use uma cartilha para a frente que anneals dentro do quadro de leitura SLA1 aberto e um primer reverso que anneals no interior do módulo GFP-kan. Identificar colônias que produtos de PCR tem o tamanho esperado e verificar por seqüenciamento. </li><li> Tela de colônias por microscopia de fluorescência para confirmar que eles têm de fluorescência da GFP. </li></ol> 2. Mutação da caixa variante clatrina (VCB) no gene SLA1 <ol><li> Introduzir um LLDLQ para AAALQ mutação no gene SLA1 (nucleotídeos 2407-2415) após uma abordagem em duas fases 15. </li><li> Em primeiro lugar, ampliar SLA1 nucleotídeos 1207-1410 e 2427-2589 pelo PCR e clonar os fragmentos em NotI / BamHI e EcoRI / SalI locais de pBluescriptKS, respectivamente. </li><li> Subclone para os sites BamHI / EcoRI um fragmento de PCR contendo URA3. </li><li> Cleave o plasmídeo resultante com NotI / SalI, isolar o fragmento URA3 de purificação gel, e introduzi-la por transformação de lítio de acetato para a cepa Sla1-GFP gerado na parte 1, ou em TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801-suc2 Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Espalhe a células em placas SD complementada falta uracil. Confirme colônia-PCR e seqüenciamento que o Ura + colônias conter URA3 devidamente integradas substituindo o fragmento VCB. </li><li> Em uma segunda etapa, subclone SLA1 nucleotídeos 1207-2589 em NotI / SalI locais de pBluescriptKS. Usando o QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), os resíduos transformam VCB LLDLQ para AAALQ. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Cleave a construção resultante com BSGI / AgeI, e isolar o VCB mutante contendo fragmento de purificação gel. Cotransform o fragmento BSGI / AgeI com pRS313 (HIS3) 22 na tensão obtido na parte 2.3. </li><li> Espalhe as células na complementada placas SD sem histidina. Réplica da placa-Seu colônias + em meio de agar contendo ácido 5-fluorotic para identificar as células em que as seqüências mutantes substituído URA3, assim, regenerar o gene que contém a sla1 LLDLQ para AAALQ mutação (sla1 AAA). Confirme colônia-PCR e seqüenciamento. </li></ol> 3. Microscopia de fluorescência <ol><li> Crescem as cepas de levedura Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP gerado nas partes 1 e 2 em 4 ml de suplementada SD media a 30 ° C em um rotador no escuro até chegar a um OD 600 = 0,1-0,4. Spin-1 ml de cultura em microcentrífuga a 4.000 xg por 1 min em temperatura ambiente. Descartar ~ 950 mL do sobrenadante. Ressuspender as células do líquido restante (~ mL 50). </li><li> Depósito mL 3 da suspensão de células sobre uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger a amostra da luz. </li><li> Montagem de slides em uma objetiva de imersão em óleo 100x de um microscópio confocal girando-disco. </li><li> Localize plano focal correta de células usando brightfield iluminação ou a laser 488 nm com filtros adequados para excitar e detectar fluorescência de GFP. </li><li> Captura de lapso de tempo imagens de Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP em células com tempo de exposição de 500 ms (ou o valor apropriado) em umn intervalo de uma imagem por segundo para 150 segundos. Resultado esperado: punctae GFP rotulados irá aparecer na superfície interna de limitar membrana da célula, persistir por vários segundos, e se mover em direção ao centro da célula como o sinal desaparece rapidamente (indicando casaco desmontagem). </li><li> Selecione uma parte de uma imagem em que pontos são vistos como aparecem, permanecem por vários segundos, e desaparecem. Safra deste seção da imagem para cada quadro das imagens de lapso de tempo. </li><li> Gerar um quimógrafo representando esta seção da imagem em cada quadro dos 150 imagem lapso de tempo segundo, alinhando os quadros ao longo de um eixo de correspondente ao tempo decorrido. </li><li> Calcular a duração de cada local com base em quantos segundos (time-lapse frames) os pontos está presente no quimógrafo. Note-se que cada ponto deve &quot;curva&quot; em direção ao interior da célula, uma vez que está desaparecendo, refletindo endocitose e desmontagem da pelagem. </li><li> Compare tipo selvagem Sla1-GFP com sla1 AAA-GFP. Repita o procedimento para determinar se os resultados são estatisticamente significativos. Resultado esperado: sla1 AAA-GFP manchas persistem significativamente maior (~ 80 seg) do que do tipo selvagem (~ 30 seg), indicando um defeito na formação da camada 15. </li></ol> 4. Preparação de extrato de levedura e extracto citosólico total de células <ol><li> Inocular 3 litros de YPD com uma cepa de levedura apropriadas, como TVY614 21, e crescer a 30 ° C em uma incubadora shaker até atingir uma OD 600 = 1-2. </li><li> Centrifugar a cultura de levedura em temperatura ambiente por 20 min a 3.700 x g. Desprezar o sobrenadante, adicionar 3-5 ml de água estéril, e pipeta para cima e para baixo até que o chumbinho é completamente ressuspenso. </li><li> Despeje ~ 150 ml de nitrogênio líquido em um copo plástico de 250 ml. Flash-congelar o fermento, adicionando gotas no nitrogênio líquido em um padrão circular para evitar a aglutinação das pelotas congelados. Não deixe que o degelo pellets, adicione mais nitrogênio líquido, se necessário. </li><li> Frio um recipiente de aço inox liquidificador, vertendo o nitrogênio líquido. Permitir que o nitrogênio líquido para evaporar quase completamente. Adicione o fermento pellets congelados para o recipiente liquidificador frio. Feche o recipiente liquidificador com uma rolha de borracha frio e moer os pellets de levedura por 10 segundos. Inverter o recipiente 3-4 vezes para misturar o conteúdo e repita a etapa de moagem duas vezes. A levedura solo congelado terá uma aparência como um pó. </li><li> Frio um funil e um tubo de 50 ml com nitrogênio líquido. Utilizando o funil frio, transfira o fermento solo para o tubo. A levedura solo congelado pode ser armazenar a -80 ° C ou usado imediatamente. </li><li> Para obter o extrato de citosólica para o ensaio de afinidade GST-proteína de fusão (Parte 5), 3 g de peso do solo congelado TVY614 fermento em um tubo de 15 ml cônico e ressuspender em 3 ml de tampão A temperatura ambiente (10 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma). </li><li> Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois colocar no gelo. </li><li> Ultracentrífuga o extrato a 4 ° C por 20 min a 300.000 x g. Transferir cuidadosamente o (extracto citosólico) sobrenadante para um tubo cônico com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Manter o extrato citosólica no gelo. </li><li> Adicionar 100 l de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A. É conveniente cortar a extremidade da ponta, a fim de facilitar a pipetagem as contas. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferir o (extracto citosólico) sobrenadante para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada. </li><li> Para obter extratos de células total para co-imunoprecipitação experimentos (parte 6), use tensão TVY614 (WT SLA1), a cepa sla1 AAA carregando um LLDLQ para AAALQ mutação gerada em Part 2 em TVY614 fundo, e uma cepa sla1 carregando uma supressão do SLA1 gene, tais como GPY3130 23. G peso 2 da levedura terreno correspondente congelados em tubos cônicos e ressuspender-los em 2 ml de tampão A temperatura ambiente, contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma) e 2% Triton X-100. </li><li> Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois incubar no gelo durante 10 min, periodicamente, misturando por inversão. </li><li> Transferir o material para tubos de microcentrífuga e girar a 4 ° C por 15 min a 16.000 xg (velocidade máxima em microcentrífuga). Transferir cuidadosamente o sobrenadante (extrato celular total) para um tubo cônico no gelo utilizando uma pipeta sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferência o sobrenadante (extrato total) para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada. </li></ol> 5. GST-fusion ensaio de afinidade de proteínas <ol><li> Amplificar por PCR um fragmento containing a variante Sla1p caixa-clatrina (VCB) (resíduos 803-807), cloná-lo em pGEX-5X para obter pGEX-5X-VCB. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Usando pGEX-5X-VCB como um modelo e os QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), mutação da VCB resíduos LLDLQ AAALQ para obter pGEX-5X-vCBmut. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Expressar GST e proteínas de fusão GST-VCB e GST-vCBmut em E. coli (BL21 DE3), purificar usando glutationa-Sepharose, saem da contas com glutationa reduzida, diálise contra PBS, e determinar a concentração de proteína. </li><li> Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: GST, GST-VCB e GST-vCBmut, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A, e 50 mcg de dialized GST, GST -VCB, ou proteínas GST-vCBmut fusão. </li><li> Girar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a ligação. </li><li> Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A. Adicionar 1 ml de extrato de levedura citosólica - preparado como descrito na Parte 4 - a cada tubo. </li><li> Girar os tubos de 1 h, a 4 ° C, rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% de tempo Triton X-100, e 1 com tampão A. </li><li> Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior. </li><li> Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g. </li><li> Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin liga-se a GST-VCB, mas não para GST ou GST-vCBmut. Também analisar as amostras por SDS-PAGE para confirmar o carregamento semelhante das proteínas de fusão GST. </li></ol> 6. Co-imunoprecipitação ensaio <ol><li> Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: WT (wild type SLA1), sla1 AAA, e sla1Δ, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A, e 2 mg de um coelho de anticorpos anti-Sla1p. </li><li> Girar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A contendo 1% de Triton X-100. </li><li> Adicionar 1 ml do correspondente total de extratos de levedura preparada na Parte 4: SLA1, sla1 AAA, e sla1Δ. Girar 1 h, a 4 ° C. </li><li> Rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% Triton X-100, e uma vez com tampão A. </li><li> Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior. </li><li> Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g. </li><li> Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin co-imunoprecipitados com Sla1p tipo selvagem, mas não com sla1 AAA, ou na amostra sla1Δ. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Análise de Sla1p adaptador de clatrina em locais endocítica de células vivas por microscopia de fluorescência. Um quadro (esquerda) de um vídeo e kymographs correspondente (direita) de células de levedura expressar Sla1-GFP ou sla1 AAA-GFP carregando um LLDLQ à mutação AAALQ. Tanto do tipo selvagem e mutante Sla1-GFP foram expressas a partir do locus SLA1 endógena. Endocítica locais são observadas como pontos brilhantes distribuídos na periferia da célula (imagens à esquerda). A área entre as linhas brancas corresponde à região de onde kymographs foram gerados. Filmes foram tiradas a uma taxa de quadros de 1 frame / sec. Observe a vida útil mais longa da Sla1-GFP na LLDLQ para AAALQ mutante (sla1 AAA) em relação ao tipo selvagem (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Interação física entre clatrina ea caixa Sla1p variante-clatrina. GST fundido a Sla1p fragmento aa798-813 contendo a seqüência LLDLQ (GST-VCB), o correspondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), ou GST sozinho (GST) eram obrigados a glutationa-Sepharose contas e incubadas com um extrato de wild-citosólica levedura células tipo. As proteínas associadas foram eluídos e analisadas por immunoblotting (IB) para cadeia pesada clatrina.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Vesículas revestidas por clatrina (CCV) participar de endocitose e transporte do trans Golgi rede e endossomos, vias conservadas que são fundamentais para a biologia célula eucariótica. As abordagens descritas neste trabalho métodos são úteis para estudar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela formação CCV, em especial as interações entre proteínas e adaptador de clatrina. GST-fusion afinidade proteínas e co-imunoprecipitação ensaios permitir o teste de associação física entre um a...

<table border="1"><th> Material </th><th> Companhia </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> protease cocktail inibidor </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

A principal via endocítica inicia com a formação de vesículas revestidas por clatrina (CCVS) que transportam cargas da superfície da célula para endossomos 1-6. CCVS distinguem-se por uma estrutura poliédrica de clatrina que reveste a vesícula de membrana e serve como um andaime mecânico. Clatrina casacos são montados durante a formação das vesículas de indivíduo triskelia clathrin, a forma solúvel de clatrina composto por três subunidades de pesos leves e três de cadeia 7,8. Porque o triskelion não tem a capacidade de se ligar à membrana diretamente, clathrin adaptadores de ligação são críticos para ligar a malha formando clatrina para a membrana através da associação com lipídios e / ou proteínas da membrana 9. Adaptadores também pacote de carga proteína transmembrana, como receptores, e podem interagir entre si e com outros componentes da formação CCV máquinas 9. Mais de vinte adaptadores clathrin têm sido descritos, diversos estão envolvidos na endocitose mediada clathrin localizar e outros para o Golgi trans rede ou endossomos 9. Com a exceção de HIP1R (levedura Sla2p), todos os adaptadores conhecidos clathrin ligar para o domínio N-terminal da hélice da cadeia clathrin pesados ​​9. Adaptadores são proteínas clatrina modular composta de domínios cruzados conectados por não estruturados linkers flexível. Dentro destas regiões linker, curto motivos de ligação mediar interações com o domínio N-terminal clatrina ou outros componentes da formação de vesículas máquinas 9. Dois distintos clatrina-binding motivos foram definidos: a caixa de clatrina e do W-box 9. O consenso seqüência clatrina-box foi inicialmente definido como L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, mas variantes foram descobertas posteriormente 11. O W-box está em conformidade com o PWxxW seqüência (onde x é qualquer resíduo). Sla1p (Lethal sintético com ligação às proteínas actina-1) foi originalmente identificado como uma proteína de actina associados e é necessário para a estrutura normal de actina do citoesqueleto e dinâmicas em locais endocítica em células de levedura 12. Sla1p também se liga o sinal de triagem NPFxD endocítica e é fundamental para endocitose de carga que transportavam o sinal NPFxD 13,14. Mais recentemente, foi demonstrado Sla1p para ligar clatrina através de um motivo semelhante à caixa de clatrina, LLDLQ, denominado uma variante caixa-clatrina (VCB), e funcionar como um adaptador endocítica clathrin 15. Além disso, Sla1p tornou-se um marcador muito utilizado para o revestimento endocítica em células vivas estudos de microscopia de fluorescência 16. Aqui usamos Sla1p como um modelo para descrever abordagens para estudos adaptador clathrin interação. Nós nos concentramos em microscopia de fluorescência de células vivas, GST-pull down, e co-imunoprecipitação métodos.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K visualizações.  Colorado State University. Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Biologia

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Estimulação da Citoplasmáticas DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...