MKK gracias Ingeniería del Reino Unido y Ciencias Físicas Research Council (EPSRC) La vida del programa Ciencias de la interfaz de una beca de personal. También queremos agradecer a los fondos por la Biotecnología del Reino Unido y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC).

Los protocolos para la preparación de la muestra Flim no difieren de los de confocal o de ancho de campo basado en la intensidad de microscopía de fluorescencia. La adquisición de datos es seguido por la tarea principal de análisis de datos, es decir, la extracción de los tiempos de vida de fluorescencia de los datos en bruto. Una vez que estos han sido obtenidos, interpretación de los datos ayuda a verificar o refutar hipótesis. 1. Células de la tinción con rotores moleculares <ol><li> Preparar una solución madre (10 ml) mediante la disolución de aproximadamente 1 mg / ml del colorante en un disolvente apropiado (por ejemplo metanol para BODIPY C-12) 6,7 utilizando una balanza de precisión y una pipeta. </li><li> Las células (una línea celular de cáncer de modelo, HeLa, en nuestro caso) a teñir se cultivan en una placa en multipocillos con una superficie inferior coverslide para microscopía, en una incubadora a 37 ° C con un 5% de CO 2 atmósfera hasta ~ 80% confluente . </li><li> Añadir 10 a 20 l de la solución madre a las células vivas que crecen en un multi-well placa (SmartSlide 50 micro-incubación sistema, WaferGen) en 4 ml de Opti-MEM (GIBCO) por pocillo de una placa de 6 pocillos. Esto produce una concentración de colorante de micro-molar en el pozo. </li><li> Volver la placa de múltiples pocillos a una incubadora a 37 ° C con un 5% de CO 2 atmósfera durante 10-45 minutos para la tinción. </li><li> Retirar la placa de múltiples pocillos de la incubadora y lavar las células 3-4 veces con 4 ml de medio de cultivo celular ópticamente transparente (por ejemplo Opti-MEM) para eliminar el exceso de tinte. </li><li> Colocar la placa multipocillo de la platina del microscopio y conectarse a un controlador de temperatura / 5% de CO 2 de entrada de gas según sea necesario, en preparación para la imagen. </li></ol> 2. Flim de los fluorescentes de los rotores moleculares en las células <ol><li> Colocar la muestra en la platina del microscopio y obtener una imagen de transmisión y fluorescencia para identificar las células fluorescentes. Un diagrama esquemático del montaje experimental se muestra en la fig. 1.Verifique que emana de fluorescencia de la expe lugaresCTED (por ejemplo, la membrana celular, el citoplasma). Obtener un espectro de emisión de fluorescencia, y verificar que es la del tinte o de proteína era de esperar, en este caso, el espectro del rotor molecular. Como control negativo, la imagen de una muestra no manchado y verificar que no fluorescencia. Aunque este paso no es esencial especialmente para Flim, es una buena práctica en general y no ayuda a verificar que la muestra es lo que usted piensa que es. </li><li> Cambiar a modo de Flim - esto se logra fácilmente al mover un espejo de la trayectoria del haz de detección de fluorescencia (&quot;detector externo&quot; botón &quot;camino del haz de ajuste&quot; del panel sobre el software Leica TCS SP2 de control de la adquisición). Un filtro adecuado emisión de fluorescencia para bloquear cualquier luz de excitación de alcanzar el detector debe estar en la Marcha de los rayos de detección de fluorescencia. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Figura 1. Dispositivo experimental de Flim el dominio del tiempo utilizando corriente alternaonfocal microscopio de barrido láser. <ol start="3"><li> Analizar la muestra y comprobar, en el ordenador que controla la adquisición Flim, que la tasa de recuento del detector (barra de color negro marcado CFD de software de adquisición de control de la Becker y Hickl SPC 830 placa) no es más que aproximadamente el 1% de la tasa de repetición láser ( barra verde con la etiqueta de adquisición del software de sincronización de control). Si lo es, reducir la intensidad de excitación láser, por ejemplo, mediante la colocación de un filtro de densidad neutra en la trayectoria del haz láser, para evitar la recogida hasta pila-curvas distorsionadas decaimiento de fluorescencia. </li><li> Adquirir una imagen de Flim, por lo general durante 3-5 minutos, detener la exploración y guardar los datos en bruto (uno de datos en 3D &quot;cubo&quot; que consiste en coordenadas espaciales x e y, y el tiempo). </li><li> Abra los datos en bruto en el paquete de software de análisis de fluorescencia de la caries, por ejemplo TRI-2 14 u otro software comercial, para mostrar la imagen la intensidad de fluorescencia. Esto es simplemente el decaimiento de fluorescencia integrado, es decir, el área bajo la curva de caída de fluorescencia, en cadapíxel. </li><li> Seleccione un píxel típica colocando el cursor sobre él, e inspeccionar el decaimiento de fluorescencia en ese píxel. Si el recuento de pico es inferior a 100, usar binning espacial de pixeles. Los recuentos de pixeles adyacentes (por ejemplo 3x3 o 5x5) se añaden en el píxel central, de modo que un recuento pico más alto se obtiene allí. Esto proporciona una mayor precisión estadística para el siguiente paso. Alternativamente, la medición puede ser repetida para un tiempo de adquisición más largo (paso 5). Para el 30-50min, un recuento de aproximadamente 10 veces mayor pico (y los recuentos totales) se obtiene, pero esto es demasiado tiempo un tiempo de adquisición para la mayoría de las muestras biológicas, debido al peligro de introducir artefactos debido al movimiento de la muestra, la deriva de microscopio, fototoxicidad y photobleaching. </li><li> Seleccione un valor de píxeles umbral global (por encima del cual la decadencia de un píxel está equipado) y aplicar un ajuste simple decaimiento exponencial de la imagen. El resultado se obtiene una vida útil de fluorescencia para cada píxel por encima del umbral, que luego es codificada encolor. Cada pixel es de color con el resultado del ajuste, y un mapa obtenido se Flim. Compruebe los reducidos valores de chi-cuadrado de píxeles diferentes - en torno a 1 (y hasta a 1,3) indica un buen ajuste. Inspeccione los residuos correspondientes, los cuales deben ser distribuidos al azar en torno a cero. </li><li> Las parcelas de toda la vida de fluorescencia histograma con qué frecuencia se producen tiempos de vida ciertos fluorescencia frente a la vida de fluorescencia en sí. Ajustar la gama de colores de tal manera que la distribución de fluorescencia vida encaja en la gama de colores. </li><li> Si un ajuste monoexponencial no produce un valor Chi-cuadrado de alrededor de 1 (y hasta 1,3), y hay una desviación sistemática de los residuos de cero, un modelo más sofisticado se requiere. Por ejemplo, trate de ajustar un modelo exponencial doble para los decaimientos de fluorescencia, para dar cuenta de dos ambientes diferentes de la sonda puede estar adentro El ajuste también se dan los factores pre-exponenciales o amplitudes que dan una indicación de la cantidad relativa de tinte en una medio ambienteción o el otro. Alternativamente, una función exponencial estirada puede ser apropiado para dar cuenta de una distribución de tiempos de vida de fluorescencia. </li><li> Los resultados para los tiempos de vida de fluorescencia, los factores de pre-exponencial, y la razón de por vida y la relación de factor pre-exponencial para cada píxel puede ser codificado en color. Cada pixel es de color de acuerdo a su valor, y el contraste de vidas debido a la fluorescencia, los factores pre-exponenciales y sus relaciones se obtiene. Una vez más, comprobar los reducidos valores de chi-cuadrado (que también puede ser codificado en color y se muestra como una imagen) - Alrededor de 1, y hasta a 1,3) indica un buen ajuste. Inspeccione los residuos, que deben ser distribuidos al azar en torno a cero. </li><li> Histogramas de fluorescencia de toda la vida debe acompañar a todas las imágenes para una fácil visualización de los valores medios de vida de fluorescencia, y la distribución de fluorescencia vida. </li></ol> 3. Los resultados representativos Decae fluorescencia medida parael rotor fluorescente molecular a aumentar la viscosidad en mezclas de metanol / glicerol se muestra en la figura. 2. Los decaimientos de fluorescencia son monoexponencial, y la vida de fluorescencia varía notablemente en función de la viscosidad. Se aumenta de alrededor de 300 ps en metanol (viscosidad 0,6 cP) a 3,4 ns en el 95% de glicerol (viscosidad 950 cp). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Figura 2. Perfiles de decaimiento de fluorescencia para BODIPY C-12 en mezclas de metanol / glicerol de viscosidad variable. 6 La trama de calibración logarítmica de vida de fluorescencia frente a τ viscosidad η para el rotor molecular fluorescente se muestra en la fig. 3. Se trata de una línea recta como lo exige la ecuación de Förster Hoffman 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Ecuación 1" /> donde k es 0 el radiativtasa constante e, y la Z y X son constantes, con 0 &lt;x &lt;1. Tomando el logaritmo en ambos lados rendimientos <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Ecuación 2" /> donde x es el gradiente de la línea recta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Figura 3. Un gráfico de la viscosidad de registro de registro de por vida frente a la fluorescencia de BODIPY C-12 da una línea recta de acuerdo con la ecuación de Förster-Hoffmann. 6 Después de la incubación de las células vivas con el rotor molecular fluorescente una distribución puntiforme colorante se observa en las imágenes de fluorescencia. Fli imágenes de células HeLa incubadas con un meso-sustituido colorante BODIPY se muestra en la figura. 4. Los decaimientos de fluorescencia en cada píxel de la imagen puede ser adecuadamente equipado con un único modelo de decaimiento exponencial. Figura 4. (A) La intensidad de fluorescencia y (b) imágenes Fli de células HeLa teñidas con BODIPY C-12. Las regiones brillantes y puntiformes presentan una vida útil más corta que en otras regiones. Este liftime más corta corresponde a una viscosidad más baja en los puntos lagrimales, probablemente gotitas de lípidos, de acuerdo con la ecuación de Förster-Hoffmann. Representando los tiempos de vida extraídos de cada píxel, se obtiene un histograma de fluorescencia vida de toda la imagen como se muestra en la fig. 5. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Figura 5. Histogramas de vida de fluorescencia de imágenes Fli de células HeLa teñidas con meso-sustituidos rotores moleculares BODIPY.

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C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Flim ofrece algunas ventajas clave sobre la intensidad basada en imágenes de fluorescencia. Se puede informar sobre los eventos fotofísicas que son difíciles o imposibles de observar por imágenes de la intensidad de fluorescencia, ya que se pueden separar de los efectos de la concentración de fluoróforo. Esto es particularmente útil para el mapeo de viscosidad intracelular por imagen molecular rotores fluorescentes. La vida de fluorescencia puede ser fácilmente convertido en una viscosidad usando una curva de calibración, como se muestra en la fig. 3, independiente de la concentración de los rotores moleculares fluorescentes. En Flim puede haber artefactos que pueden complicar la interpretación de los datos. 10 artefactos instrumentales incluyen la luz dispersa, que se mostrará como un pico en la parte superior del inicio de la decadencia de fluorescencia y se puede confundir con un tiempo de decaimiento corto, o un pequeño pico después de la IRF que puede ser causada por las reflexiones en el interior del microscopio. Estos artefactos de luz dispersos puede ser identificada como talporque se pueden distinguir con la discriminación espectral - son siempre a la misma longitud de onda como la luz de excitación. Recordando que en el aire, la luz viaja a 30 cm en 1 nanosegundo ayuda a precisar el origen de las reflexiones. Filtro o fluorescencia de vidrio también puede causar un artefacto, especialmente en la fluorescencia de la muestra bajo, pero esto puede ser fácilmente identificado por tomar una medida sin la muestra: si una descomposición se obtiene bajo estas circunstancias, es debido a que el instrumento y no tiene nada que ver con la muestra! Por otro lado, nótese que autofluorescencia muestra también puede contribuir a un decaimiento de fluorescencia. Con el tiempo-correlacionada conteo de fotones simple (TCSPC), convertidor de tiempo de amplitud (TAC) no linealidades puede causar ataques pobres, pero se pueden identificar mediante el bloqueo de la excitación y brillante de luz ambiental, por ejemplo, de la fuente de luz transmitida sobre la muestra y medir el tiempo. Un fondo debe ser constanteobtenida en cada píxel de la imagen. Las regiones donde las desviaciones de un fondo constante ocurrir, nunca producirá un buen ajuste y deben ser evitados para la medición, si no pueden ser eliminadas mediante el ajuste de los parámetros para la tarjeta TCSPC. Un artefacto infame en TCSPC es fotón amontonamiento que es causada por una muy alta tasa de detección de fotones. 11,12 Esto conduce a sólo el primer fotón está temporizado, ignorando cualquier fotones posteriores debido a los componentes electrónicos son temporización ocupado y procesar el primer fotón. Pile-up conduce a un acortamiento de la vida de fluorescencia, y la mejor manera de evitar esto es mantener la tasa de recuento de fotones en torno al 1% de la tasa de repetición del láser. Punto de vista Hay varias implementaciones de Flim, y, dependiendo de la aplicación, cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes. 13 El microscopio de fluorescencia ideal sería adquirir la totalidad multidimensional fluorescencia emission del contorno de intensidad, posición, tiempo de vida, longitud de onda y la polarización en una sola medición, con una sensibilidad de fotón único, la resolución espacial máxima y el tiempo de adquisición mínimo. Actualmente no hay tecnología con esta combinación única de características, y para construir una sigue siendo un reto para los desarrolladores de instrumentación. La aplicación de nuevas técnicas físicas para los problemas importantes en la biología celular es a menudo el camino a los descubrimientos inesperados, y hay un largo camino por recorrer antes de que estemos cerca de la saturación de las capacidades de las imágenes de fluorescencia de la biología celular. En efecto, los parámetros de fluorescencia de imagen tales como la vida, el espectro y la polarización, así como imágenes con mayor rapidez en 3D en alta resolución espacial, es seguro que revelan nuevos aspectos de la biología celular.

Muestra con rotores moleculares fluorescentes Hardware: invertido confocal Leica TCS SP2 microscopio de barrido Coherente Mira 900 Ti: zafiro láser femtosegundo con un Verdi V6 láser de bombeo o de Hamamatsu PLP-10 470 picosegundos pulsadas diodo fuentes de excitación láser Becker &amp; Hickl SPC 830 tablero en 3 GHz, Pentium IV, 1 GB de memoria RAM del ordenador con Windows XP la cabeza refrigerado por Becker y Hickl PMC100-01 detector basado en Hamamatsu H5773P-01 fotomultiplicadores, montados en el puerto microscopio X1, o detectores híbridos DCC 100 detector de módulo de control Software: TRI-2 14 o SPCImage 2,8 por Becker y Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

La difusión es a menudo un importante determinante de la velocidad paso en las reacciones químicas o procesos biológicos y juega un papel en una amplia gama de eventos intracelulares. La viscosidad es uno de los parámetros clave que afectan a la difusión de las moléculas y proteínas, y cambios en la viscosidad se han relacionado con la enfermedad y el mal funcionamiento en el nivel celular. 1-3 Si bien los métodos para medir la viscosidad a granel están bien desarrolladas, microviscosidad imagen sigue siendo un reto . Mapas de viscosidad de los objetos microscópicos, como las células individuales, que hasta hace poco difícil de obtener. Mapeo de viscosidad con técnicas de fluorescencia es ventajoso porque, similar a otras técnicas ópticas, es mínimamente invasiva, no destructiva y se puede aplicar a las células vivas y tejidos. Fluorescentes rotores moleculares exhiben tiempos de vida de fluorescencia y los rendimientos cuánticos que son una función de la viscosidad de su microambiente. Torsión intramolecular 4,5 orotación conduce a la decadencia no radiativo de la parte posterior estado excitado al estado fundamental. Un ambiente viscoso reduce esta rotación o torsión, restringir el acceso a esta vía de desintegración no radiativa. Esto conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida de fluorescencia. Imágenes vida de fluorescencia (Flim) de colorantes modificados BODIPY hidrófobos que actúan como fluorescentes rotores moleculares muestran que el tiempo de vida de fluorescencia de estas sondas es una función de la microviscosidad de su entorno. 6-8 Una representación logarítmica de la vida de fluorescencia frente a los rendimientos de viscosidad del disolvente una línea recta que obedece a la ecuación de Förster Hoffman. 9 Esta trama también sirve como una curva de calibración para convertir toda la vida de fluorescencia en la viscosidad. Después de la incubación de las células vivas con el BODIPY modificada fluorescente rotor molecular, una distribución puntiforme colorante se observa en las imágenes de fluorescencia. El valor de la viscosidad obtenida en ªe puncta en células vivas es de alrededor de 100 veces mayor que la del agua y del citoplasma celular. 6,7 resueltos tiempo mediciones de anisotropía de fluorescencia ceder veces rotacionales de correlación de acuerdo con estos valores microviscosidad grandes. Mapeo de la vida de fluorescencia es independiente de la intensidad de fluorescencia, y por lo tanto permite la separación de concentración de la sonda y los efectos de viscosidad. En resumen, hemos desarrollado un enfoque práctico y versátil para asignar el microviscosidad en las células sobre la base de Flim de los rotores moleculares fluorescentes.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Bioengineering

24.8K vistas.  King's College London. Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...