Los autores agradecen a las familias de los donantes y las organizaciones de obtención de órganos involucrados en esta investigación y Martino María y Kusmartseva Irina por su ayuda de expertos. Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) en apoyo de la Red de Donantes de Órganos de páncreas con diabetes.

1. Set-up <ol><li> Casetes de etiquetas para los bloques de parafina de forma manual con un lápiz, o automáticamente con una impresora de cartucho. Incluye el identificador de los donantes (CaseID), el tipo de muestra, número de parte alícuota, y cualquier otro documento de identidad única (la hoja de Caso, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">el Apéndice 1</a> ). </li><li> Etiqueta OCT moldes como para cassettes con un marcador permanente. Cortar rectángulos de 5-10 cm de papel de aluminio. </li><li> Imprimir etiquetas o de forma manual con marcador permanente todos los viales y tubos. Incluya viales suficientes para muestras instantáneas picada congelada y tubos con medio RPMI para los envíos de frescos. Para los viales se congelaron con RNAlater, añadir 1 ml a cada RNAlater criovial. </li><li> Set-up placas de disección en materia de seguridad campana y los mostradores con los instrumentos de disección estériles (fórceps, escalpelos, hojas, gasas (4x4)), así como cassettes y moldes OCT dispuestos en orden de uso. </li><li> Prepare un baño de congelación, poniendohielo seco en una caja de tamaño mediano de espuma de poliestireno (10x10 cm) a una profundidad de al menos 3 cm y añadir isopentano hasta que el hielo seco está completamente cubierta. </li><li> Opcional: Complete un pequeño recipiente Dewar con nitrógeno líquido. </li><li> Si el páncreas es necesario para la microscopía electrónica (EM), preparar el fijador TAAB mediante la adición de 1,25 ml de paraformaldehído al 16%, 1,25 ml de glutaraldehído al 8%, y 7,5 ml de 0,1 M de PBS. Preparar fijador Lowicryl mediante la adición de 2,5 ml de paraformaldehído al 16% a 7,5 ml de PBS 0,1 M. </li><li> Preparar las soluciones utilizadas para el aislamiento de las células. Para botella de 500 ml de DMEF (con glutamina), seguir las técnicas asépticas al tiempo que añade lo siguiente: <ol><li> De suero fetal bovino (SFB): añadir 50 ml, 10% final. </li><li> La penicilina / estreptomicina (Pen / Strep, 10.000 U / ml / 10000 ug / ml stock) - añadir 5 ml Pen / Strep acciones a RPMI para la concentración final de 100 U / ml / 100ug/mL. También añadir 5 ml de una botella de 500 ml de DPBS cuando se utilizan para la celebración de los ganglios linfáticos o muestras de bazo. </li></ol></li></ol> 2. Personal <ol&gt; <li> Procedimiento que se realiza de manera óptima con tres miembros del personal sin embargo, el procedimiento puede llevarse a cabo con una persona bien entrenada. Dos individuos generalmente puede completar el procedimiento en 90 minutos. La duración real depende de la cantidad de tejidos recibidos y la facilidad para encontrar los ganglios linfáticos pancreáticos. Las muestras para aislamientos celulares se mantuvieron a 4 ° C hasta la finalización de la disección del tejido, mientras que las muestras de suero se procesan en paralelo. </li><li> Patólogo, patología asistente, o su equivalente, un miembro del personal con experiencia lleva a la manipulación de tejidos y lleva a cabo disecciones más importantes, incluyendo la división (s) de la cabeza del páncreas y la cosecha de los ganglios linfáticos pancreáticos. Los esfuerzos iniciales se dirigen hacia el páncreas seguido de un examen de la grasa peri-pancreática de los ganglios linfáticos. </li><li> Técnico de laboratorio u órgano equivalente de personal capacitado en el tejido de corte cuyas funciones principales son para pesar el páncreas y las regiones y los tejidos de acabado de bloques fijos y congelada, y de complemento congelada vIALS. Recibe el duodeno y el bazo de la asistente de patología y los procesos de estos órganos, mientras que el asistente de patología está procesando el páncreas. </li><li> Asistente de laboratorio-un miembro del personal que asiste a los otros como el bloqueo y etiquetado vial, muestra de picar para crioviales, y el procesamiento de suero. </li></ol> 3. La disección del páncreas <ol><li> Retire el duodeno y el bazo y el páncreas limpiar de grasa extraños, los vasos y los nervios mediante disección roma y cortante </li><li> Coloque el páncreas limpiado en un tablero de disección cubiertas con toallas de papel. Humedezca un bastoncillo de algodón en tinta azul y propagación en la superficie anterior del páncreas. Seque el exceso. </li><li> Opcional: Sumerja un nuevo aplicador de tinta negro y se extendió sobre la superficie posterior del páncreas. Volver páncreas a la orientación normal con superficie anterior frente prosector. </li><li> Cortar el páncreas en 3 regiones: cabeza, cuerpo y cola (Figura 1). Cortar la unión entre head cuerpo y luego dividir la porción restante en ~ porciones iguales para el cuerpo y la cola. </li><li> Pese cada región de pesos páncreas y registro (caso hoja de diagnóstico diferencial ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anexo 1</a> )). </li><li> Sección (~ 0.5 cm) de cada región del páncreas en una transversal &quot;barra de pan&quot; forma (Figura 1). </li><li> Utilice las secciones de ambas uniones entre las regiones para las muestras de picada. Dependiendo del tamaño del páncreas, una muestra de la región de unión cuerpo-cola puede ser difícil de obtener en cuyo caso el número de bloques de parafina se puede disminuir para obtener muestras picados o muestras sólo del páncreas cabeza-cuerpo región se puede obtener. Crioviales etiqueta con arreglo a la cabeza o el cuerpo para denotar la región proximal en la unión. <ol><li> Picar las piezas y se dividen en partes iguales entre los crioviales (≥ 1 gramo por dosis). La rápida congelación de los viales sin RNALater en nitrógeno líquido o hielo seco en la - suspensión isopentano a continuación, transferir tOA -80 ° C congelador. </li><li> Mantener viales con RNALater a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir el equilibrio, remix y rápidamente congelar en nitrógeno líquido o en la de hielo seco-isopentano suspensión luego se transfieren a un -80 ° C congelador. </li></ol></li><li> Eliminar las secciones alternas de bloques de parafina y PTU que comienzan con parafina (Figura 1). </li><li> Incline todas las secciones transversales a la derecha. </li><li> Lugar ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm secciones en las casetes. Si las secciones transversales son demasiado grandes, cortado por la mitad (Figura 2b). Casetes de etiquetas de color azul medio anterior como &quot;A&quot; y la mitad posterior como &quot;B&quot;. </li><li> Si las piezas son todavía demasiado grandes, corte cada sección perpendicular al corte anterior (Figura 2c). Casetes de etiquetas DC en sentido horario. Recorte las piezas más, según sea necesario para que quepa en casetes. </li><li> Bloques de números en secuencia dentro de la región, comenzando por la parte más medial. </li><li> Para los bloques de parafina, la posición Cassettes por lo que la etiqueta está a la izquierda y el lugar del tejido en el cassette, manteniendo su orientación. Cerrar la tapa de cassette y la transferencia a un recipiente con 500 ml ~ 10% de formalina neutra tamponada (MNB). Empezar fijación temporización cuando la casete último se coloca en fijador. </li><li> Para los bloques de OCT, vierta una capa delgada de octubre los medios de comunicación en el molde prelabeled a continuación, establecer el tejido en el molde y asegúrese de mantener la orientación y cubrir con el tejido octubre Rápidamente sumergir los moldes OCT en un hielo seco - suspensión de isopentano para ~ 1 minuto. Eliminar de la suspensión y el lugar en hielo seco para el almacenamiento temporal o en el congelador -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> Obtener ~ 0,5 x 0,5 cm rebanadas de la unión cabeza-cuerpo para microscopía electrónica (EM). Coloque una rebanada en el fijador TAAB y la otra rebanada en el fijador Lowicryl. Guarde los dos tipos de fijador con muestras a 4 ° C durante al menos 48 horas y / o por tiempo indefinido hasta su posterior procesamiento para EM. </li></ol> 4. Bazo, ganglios linfáticos disecciónciones y duodenal mucosa disecciones <ol><li> Aislar los ganglios linfáticos pancreáticos (PLN) de la grasa y cortar todo el tejido conjuntivo de la cápsula de los ganglios. Colóquelo en un recipiente estéril de cultivo celular que contiene DMEF. Dependiendo del número total de aislados, se divide en partes alícuotas PLN para los envíos de frescos y criopreservados aislamientos celulares, parafina y / o bloques de OCT, y los viales. Picar los ganglios grandes en trozos no mayores de 0,5 cm. </li><li> Picar no pancreáticas ganglios linfáticos y el bazo en la pequeña (0,5 cm) cubos. Colocar en fijador, los medios de octubre, o DMEM y para envío de muestras frescas o aislamientos criopreservados celular de acuerdo con las cantidades de materiales de partida. </li><li> Abra el duodeno y frote suavemente la mucosa duodenal, limpio de la mucosa con una gasa humedecida. Los cortes de secciones de la mucosa de la parafina y / o bloques congelados de PTU y las muestras de picada para viales, con y sin RNAlater. Congelar como para otras muestras. </li></ol> 5. Envuelva OCT bloques en pre-etiquetados papel de aluminio y coloque bloques de OCT y<html> viales en las cajas para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. 6. Enviar ejemplos fijos para el procesamiento de parafina <ol><li> Fijar los tejidos durante 16 horas (rango de 20 ± 4 horas) con un procesador automático de la parafina o el uso de cronometraje manual. Proceso para los bloques de parafina utilizando un procesador automático ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Anexo 2</a> ). </li><li> Incluye secciones en la orientación exacta como colocada por el prosector con la etiqueta del cassette a la izquierda. Insertar la mucosa duodenal con la superficie del corte hacia abajo para permitir el examen de la perpendicular de la mucosa hasta la submucosa. </li></ol> 7. Limpie las áreas de disección y desinfectar. Lave los instrumentos de disección y volver a esterilizar. Coloque los tejidos remanentes humanos en fijador de formol para su almacenamiento, como los desechos biomédicos. Eliminar los desechos biomédicos de acuerdo con las normativas locales plazo de un mes. 8. Actualizar el sistema de inventario de la muestra ve_title &quot;&gt; 9. Resultados representativos Este procedimiento se tramitará un páncreas humano intacto, con un muestreo representativo a través del órgano incluyendo la demarcación de las tres regiones principales, a saber, cabeza, cuerpo y cola de 2 horas. La región uncinado, que se encuentra en la región de la cabeza posterior, se incluye en la disección cabeza. El peso de páncreas media en donantes de órganos que no tienen diabetes fue 82,4 gramos (52,7 - 139,0 gramos). Pesos páncreas regionales fueron aproximadamente iguales (Figura 3). Este procedimiento también puede permitir la reconstrucción de todo el páncreas mediante diapositivas manchadas de parafina secuencial y bloques de OCT. Múltiples formatos son posibles teniendo en cuenta la máxima utilización de las tecnologías actuales y futuras. La hoja de cálculo actual caso nPOD se proporciona ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anexo 1</a> ) que se utiliza para documentar las muestras recuperadas y posteriormente processing por los tipos y cantidades alícuotas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general del procedimiento. El páncreas se procesa toda vez que mantiene orientaciones anatómicas. La región de la cabeza es más largo en el eje superior-inferior debido a la presencia del lóbulo pancreático ventral en la región posterior que incluye la región uncinado. La zona sombreada en los cruces indican las regiones utilizados para las muestras de picados en los crioviales. P, de parafina, O, octubre <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de letras para las secciones de páncreas. Cortes transversales del páncreas se pueden dividir en mitades o cuartos y letras en sentido horario. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Figura 3. Pesos de páncreas de donantes de órganos que no tienen diabetes. Lospáncreas intacto de donantes adultos (&gt; 17 años) se pesó luego se divide en regiones y pesos regionales obtenidos. Los datos son medias ± SEM (n = 15).

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	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El objetivo de este procedimiento es definir un proceso estándar de páncreas que puede ser armonizado en los distintos sitios de recolección de varios, para poder comparar los resultados obtenidos con los diferentes grupos. El método se basa en la disección estándar de prácticas de patología quirúrgica con medidas adicionales para la anotación de las regiones más importantes del páncreas seguido de intra-regionales subdivisiones. La estandarización de los métodos de procesamiento de especímenes biológico...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Incluidos los instrumentos de disección con 22 hojas de bisturí </td><td> Varios </td><td> Varios </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga (15 y 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> Estéril </td></tr><tr><td> Criotubos (1,8 ml) </td><td> VWR América del Norte </td><td> 89004-300 </td><td> Estériles, los códigos de barras opcionales </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Tinta Patología Quirúrgica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Casetes </td><td> Mercedes Médico </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% formalina tamponada neutra </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> OCT medio de congelación </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Moldes </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Varios tamaños </td></tr><tr><td> Isopentano </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Escalofriante baño de octubre </td></tr><tr><td> El hielo seco </td><td></td><td></td><td> Escalofriante baño de octubre </td></tr><tr><td> El nitrógeno líquido en el vaso Dewar </td><td></td><td></td><td> Coloque los crioviales de congelación </td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular (100 mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Estéril </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Almacén estéril, refrigerados, incluidos glutamina </td></tr><tr> &lt;td&gt; suero bovino fetal </td><td> Cellgro </td><td> 35 a 010 CV </td><td> Alícuotas estériles, congelados tienda </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina / antifúngico </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Alícuotas estériles, congelados tienda </td></tr><tr><td> Escriba 9 de parafina </td><td> Richard Allan-Científico </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Estéril </td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> EM Ciencias </td><td> 15710 </td><td> Haga tienda fresca, refrigerada </td></tr><tr><td> 8% de glutaraldehído </td><td> EM Ciencias </td><td> 16019 </td><td> Haga tienda fresca, refrigerada </td></tr><tr><td> Nivel de Bioseguridad 2 campana </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-bajo el congelador </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Impresora Casete Sakura </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Procesador automático de parafina </td></tr><tr><td> Estación de parafina incrustación </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos y equipos.

collection protocol for human pancreas

Esta disección y el procedimiento de muestreo fue desarrollado para la Red de Donantes de Órganos de páncreas con diabetes (nPOD) programa para estandarizar la preparación de páncreas se recuperó de los donantes de órganos cadavéricos. El páncreas se divide en 3 grandes regiones (cabeza, cuerpo, cola), seguidos de las secciones transversales de serie en toda la medial al eje lateral. Secciones alternas se utilizan para parafina fijo y frescas bloques congelados y muestras remanentes se pican para complemento preparaciones de muestras congeladas, ya sea con o sin inhibidores de RNAsa, para el ADN, ARN, o aislamiento de las proteínas. El objetivo general del procedimiento de disección de páncreas es de probar todo el páncreas, mientras que el mantenimiento de la orientación anatómica. Endocrino heterogeneidad celular en términos de composición islote, tamaño, y los números se informó de islotes humanos en comparación con 1 islotes de roedores. La mayoría de los islotes humanos de la cabeza del páncreas, regiones del cuerpo y la cola están compuestos de insulina-containing células beta seguido por las menores proporciones de glucagón que contiene alfa-células y que contienen somatostatina-delta-células. Polipéptido pancreático que contienen las células del PP y la grelina que contienen células épsilon, pero también están presentes en pequeñas cantidades. En contraste, la región uncinado contiene islotes que están compuestos principalmente de pancreáticos polipéptido que contienen células PP 2. Estas variaciones de los islotes regionales surgen de las diferencias de desarrollo. El páncreas se desarrolla a partir de las yemas de páncreas ventral y dorsal del intestino anterior y después de la rotación del estómago y el duodeno, se mueve el lóbulo ventral y se fusiona con el dorsal 3. El lóbulo ventral forma la parte posterior de la cabeza incluyendo el proceso uncinado mientras que el lóbulo dorsal da lugar a que el resto del órgano. La variación de páncreas Regional se informó también a la región de la cola que tiene una mayor densidad de islotes en comparación con otras regiones y los componentes derivados del lóbulo dorsal-se someten a una atrofia selectiva de la diabetes tipo 1 <sa&gt; 4,5. Órganos y tejidos adicionales a menudo son recuperados de los donantes de órganos y son los ganglios linfáticos, el bazo páncreas y páncreas no los ganglios linfáticos. Estas muestras se recuperaron con formatos similares como para el páncreas con la adición de aislamiento de células crioconservados. Cuando el duodeno proximal se incluye con el páncreas, la mucosa duodenal puede ser coleccionada para los bloques de parafina y congeladas y preparaciones picadas se congelaron.

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Collection Protocol for Human Pancreas

Este video muestra la disección de un procedimiento para la tramitación de páncreas humano en los formatos de almacenamiento. Orientación anatómica se mantiene a lo largo de las regiones pancreáticas para permitir la definición de la composición islote regional y densidad.

Colección Protocolo de páncreas humano

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

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14.7K vistas.  University of Florida. Este video muestra la disección de un procedimiento para la tramitación de páncreas humano en los formatos de almacenamiento. Orientación anatómica se mantiene a lo largo de las regiones pancreáticas para permitir la definición de la composición islote regional y densidad.

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Investigación

Medicina

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

Un protocolo detallado para la Vigilancia transpiración utilizando un nuevo, pequeño, dispositivo inalámbrico

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo murino de trasplante de páncreas mediante una técnica modificada del pun ¢ o

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Disección del páncreas de ratón para análisis histológico y perfiles metabólicos

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

Pancreaticojejunostomía lateral robótica para la pancreatitis crónica

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

Trasplante de riñón asistido por robot

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

Perfusión pancreática normothermic ex vivo para la preservación de los aloinjertos pancreáticos antes del trasplante

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.